满满的干货（三）：质粒DNA的提取，困难解决了吗？

综合前两期的“满满的干货（一）”和“满满的干货（二）”，大家对于质粒DNA的提取应该会有一定程度的了解，那么在使用过程中，很多人觉得自己提取的质粒效果还是很差，究竟是怎么回事呢？

本期给大家在准备了一些质粒DNA提取时需要注意的事项，这些结果包含了浓度偏高或低的原因及解决方案：

原因及解决方案

01质粒浓度偏高

存在RNA残留：未完全消化RNA（RNase A失效或未添加），导致A260值虚高。

解决方案

提取前一定要在溶液Ⅰ中加入RNase A，如果已加完RNase A的溶液Ⅰ在冰箱放置久了，一定要补加RNase A。

02细菌培养状态不佳

• 细菌密度过低：若细菌培养液OD值（如OD600）未达到对数生长期后期（通常1.0-1.5），菌体数量不足，会直接导致质粒总量减少。

• 培养时间过长：超过对数生长期后，细菌进入稳定期或衰退期，可能释放核酸酶降解质粒，同时菌体裂解难度增加。

• 细菌污染，若培养液中混入杂菌，杂菌会争夺营养，导致目标细菌生长受抑，同时可能释放酶类破坏质粒。

• 菌液长期存放。

解决方案

（1）调整培养时间至12-16小时，但避免过度生长导致质粒丢失。

（2）确保使用合适的培养基（如LB）和正确的抗生素浓度。

（3）接种前用新鲜活化的单菌落，避免使用陈旧或多次传代的菌液。

03质粒拷贝数低

• 某些质粒（如大质粒或低拷贝质粒）天然拷贝数低（如pBR322为低拷贝）。

• 插入片段过大（>10kb）导致复制效率下降。

解决方案

（1）选择高拷贝质粒载体。

（2）若需保留低拷贝质粒，可增加培养体积（如从5mL增至10-20mL），提高质粒总量。

04质粒降解

在提取过程中，如果操作环境存在核酸酶（如DNase、RNase），或者提取过程中剧烈震荡、温度变化过大等，可能会导致质粒降解，使提取的质粒浓度降低。

解决方案

（1）在提取过程中，使用无核酸酶的试剂和耗材，如无核酸酶的水、无核酸酶的离心管等。

（2）操作时动作要轻柔，避免剧烈震荡。严格控制温度，尤其是在裂解和洗脱等关键步骤。

原因及解决方案

05裂解不充分

菌液量过多。

碱裂解（Solution II）时间过短：无法彻底破坏细菌细胞膜和释放质粒；时间过长（超过5分钟）：会导致基因组DNA断裂并与质粒共沉淀，同时强碱可能降解质粒。

裂解液未混匀。

解决方案

（1）采用适量的菌液量进行提取。

（2）确保充分裂解，但时间不要超过5分钟。

（3）加完Solution II一定要轻柔且充分混匀。

06中和与离心不彻底

• Solution III未充分混匀，质粒复性不完全；

• 离心转速/时间不足（如<12,000rpm或<10分钟），沉淀未分离。

解决方案

（1）加入Solution III后，立即颠倒混匀8-10次，直至出现均匀白色絮状沉淀。

（2）12,000-13,000rpm离心10-15分钟，确保沉淀完全。

07洗脱液使用不当

• 洗脱液体积过大。

• 洗脱液pH不合适。

• 洗脱温度不足：未将洗脱液预热至60℃左右，低温会降低质粒从硅胶膜上的解离效率。

• 加完洗脱液未静置直接离心。

解决方案

（1）洗脱时调整洗脱液添加体积，洗脱液体积过大会稀释浓度；体积过小则无法充分湿润硅胶膜，导致质粒洗脱不完全。

（2）洗脱液（ddH2O或TE缓冲液）pH偏酸性（<7.0）会降低质粒溶解度，影响洗脱效率，建议pH8.0-8.5。

（3）洗脱液加入后需静置1-2分钟，质粒充分溶解并释放后再离心。

08操作损耗

• 离心后上清未完全吸弃，稀释菌体。

• 重悬缓冲液（Solution I）未充分混匀，菌体沉淀未分散。

解决方案

（1）菌体离心后，用移液器彻底吸尽上清（残留量<10μL）。

（2）加入Solution I后，用涡旋仪或移液器反复吹打至沉淀完全分散（无可见颗粒）。

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