上海优宁维生物科技股份有限公司

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9689707/

 

研究背景：

研究显示，粪便样本中的蠕虫卵壳、硬而粘的角质层、碎屑和纤维，可能是导致阳性样本中提取的DNA，PCR会出现假阴性结果的原因。另研究指出，粪便样本中不仅发现了DNA抑制剂，还发现了各种PCR抑制剂，且不同样本中PCR抑制剂的质量和数量各不相同。因此，为了提高从粪便残渣中分离寄生虫的效率，打破寄生虫坚固的卵壳或角质层，减少粪便样本中PCR抑制剂的成分，DNA提取方法至关重要。

本文主要针对四种DNA提取方法进行比较，分别是：传统的苯酚-氯仿技术（P）、改进的玻璃珠苯酚-氯仿技术（PB）、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Q）和 QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（QB）。

 

材料与方法：

共采集感染肠道寄生虫85份粪便样本，寄生虫包括蛔虫（9 例）、毛滴虫（5 例）、盘尾丝虫（20 例）、钩虫（14 例）和高吸虫（37 例）。分别用以上四种方法去提取感染者粪便中的DNA。

 

结果分析：

1.提取到的DNA质量

使用分光光度计测定提取的DNA纯度。

对于DNA纯度的二次测量后，QB的A260/230比率最高（几何平均数 = 1.62）（图1A）。通过QB方法提取到的DNA的A260/230比率明显高于Q方法（Q的几何平均数是1.10）（P < 0.01）（图1A，E）。用P和PB方法提取的 DNA 不纯。

图1. 通过苯酚-氯仿提取法（P）、带玻璃珠的苯酚-氯仿提取法（PB）、QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（Q）和 QIAamp Power Fecal Pro DNA Kit（QB）提取的基因组 DNA 的 OD260/230 吸光度比比较。

 

2.通过PCR检测肠道寄生虫

通过比较肠道寄生虫的PCR阳性率，评估各种DNA提取方法的效率。

使用Q和QB方法，提取的DNA样本阳性率都很明显（表1），QB法的PCR检测率明显高于Q法（P < 0.01）（图 2）。

传统P方法提取的DNA样品在PCR检测中都呈阴性。PB法与P法的PCR检出率相差不大（P＞0.05）（图3）。

 

表1. 根据DNA提取方法检测肠道寄生虫PCR阳性率比较。Bh、As、Tt、Hw、Ss分别代表不同的寄生虫。

 

图2. 使用四种方法从每位患者的粪便样本中提取的DNA进行PCR检测。其中A、B、C、D代表不同的寄生虫。M：DNA 标记；Neg：阴性对照；Pos：阳性对照。

 

图3. 检测肠道寄生虫的DNA提取方法比较。Bh、As、Tt、Hw、Ss分别代表不同的寄生虫。** 差异采用卡方检验（P < 0.01），ns：差异不显著（P > 0.05）

 

3.评估提取的DNA样品中的PCR抑制剂

在PCR阴性样本中添加含有每种寄生虫目标基因的质粒DNA，若可以观察到目标基因的扩增子，则无PCR抑制剂，反之有。

结果显示，与使用 P 方法相比，使用Q方法的PCR阳性率更高（P < 0.01）。在质粒突变后，用QB方法提取的33个PCR阴性样本中有28个（84.8%）转为阳性（表2）。只有5个DNA样品（5.9%）的PCR检测结果仍为阴性。这些结果表明，用QB方法提取DNA的PCR抑制剂最少。因此，QB 是去除粪便样本中污染的 PCR 抑制剂最有效的方法。

 

表2. 检测肠道寄生虫的 PCR 阳性率比较。Bh、As、Tt、Hw、Ss分别代表不同的寄生虫。

 

文献中好物

方法：Q

QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit (50) ；货号：51604；描述：从粪便样本中分离 gDNA

特点：

☆ 简化、快速的纯化方案

☆ 不使用有害有机化学品

☆ 可在 QIAcube 上自动完成

☆ 有效去除 PCR 抑制剂

☆ 下游检测灵敏度高

 

方法：QB

QIAamp PowerFecal Pro DNA Kits；货号：51804；描述：用于从粪便和肠道样本中分离微生物DNA

特点：

☆ 高效裂解粪便和肠道样本中的细菌和真菌

☆ 与其他方法相比，可多提取 20 倍的 DNA

☆ 与其他方法相比，在测序中产生更高的α多样性

☆ 回收不含抑制剂的 DNA，可直接用于下一代测序应用

☆ 在 QIAcube Connect 上实现工作流程自动化

 

更多好物推荐

 

QB法试剂盒在其他文献中的应用

1.Gut microbiome dysbiosis across early Parkinson’s disease, REM sleep behavior disorder and their first-degree relatives

https://www.nature.com/articles/s41467-023-38248-4

杂志：Nature Communications（影响因子：16.6）

已有的研究发现微生物-肠-脑轴在帕金森病（PD）中发挥重要作用，且REM睡眠行为障碍患者（RBD）是帕金森病（PD）的特异性前驱标志物之一。本文的研究结果表明，在年轻的RBD-FDR受试者中，当RBD发生并开始出现时，RBD样肠道生态失调发生在PD的前驱期。

在此文章中，粪便微生物DNA提取试剂盒用QIAamp PowerFecal Pro DNA Kit（货号：51804），也可有效裂解，高效去除抑制剂，助力实验成功，原文解析可点击查看。

https://mp.weixin.qq.com/s/enOdn9rm7juH3hWjIiWhqQ

 

2.Microcins mediate competition among Enterobacteriaceae in the inflamed gut

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5145735/

杂志：Nature（影响因子：64.8）

肠杆菌科细菌属于革兰氏阴性菌，包括共生菌、原发性和机会性病原体，是全球发病和死亡的主要原因之一。本篇研究首次证明，微球蛋白介导了发炎肠道中肠杆菌科细菌之间和种内的竞争。此外，还证明了微球蛋白可以作为窄谱治疗药物来抑制肠道病原体并减少肠杆菌的繁殖。文中的材料方法中是使用QIAamp Fast DNA Stool Mini Kit（货号：51604）来获取高质量的DNA，后续进行PCR扩增。

 

3.Intestinal permeability, microbiota composition, and expression of genes related to intestinal barrier function of broiler chickens fed different methionine sources supplemented at varying concentrations

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10140141/

杂志：Poultry Science（影响因子：4.4，动科一区）

肉鸡的肠道健康受日粮氨基酸浓度的影响，本文主要为了研究不同蛋氨酸来源对肉鸡生产性能、肠道屏障功能和肠道微生物群的影响，进行了两项实验。在第一项实验中，使用QIAamp PowerFecal Pro DNA 试剂盒（货号 51804）分离所有回肠和盲肠内容物的微生物DNA。

还有更多使用到QIAamp PowerFecal Pro DNA Kits（货号：51804）的文献，供您参考。

 

4.Lung Mycobiota α-Diversity Is Linked to Severity in Critically Ill Patients with Acute Exacerbation of Chronic Obstructive Pulmonary Disease

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10100765/

杂志：Microbiology Spectrum （影响因子：3.7）

 

5.Alterations in the Gut Microbiome and Metabolisms in Pregnancies with Fetal Growth Restriction

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC10269609/

杂志：Microbiology Spectrum （影响因子：3.7）

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