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分子生物学相关实验步骤及注意事项（一）
 
刚进实验室的小伙伴们，当你们在进行RNA的提取，RT-PCR和QPCR实验时，是否会有这样的感受，明明是按照实验步骤往下做的，实验结果却不如人意，甚至很糟糕呢？小编我也曾经被实验狠狠地虐过呢~为了减少实验对亲们的打击，在此献上自己在实验过程中的一些小经验，希望能帮助到各位小伙伴们~

（一）RNA提取篇

在RNA提取过程中，严格防止RNA酶的污染，并设法抑制其活性，这是本实验成功的关键。对于人、动植物组织、细菌、细胞等多种RNA的提取，Trizol法效果良好，可同时分离一个样品内的RNA/DNA/蛋白质。Trizol裂解细胞，溶解细胞内含物，同时因含有RNase抑制剂可保持RNA的完整性。

如果对RNA纯度要求极高或者样品难以提取，也可以选择使用RNA提取试剂盒。有同学用过国内的天根，效果还好。小编曾用过Omega的RNA提取试剂盒，效果也挺好的，Promega的总RNA提取试剂盒对多种样本的小量纯化提取效果也还不错。

动植物总RNA提取——Trizol法的具体步骤如下：

1、将组织物研磨后，取50-100mg加入至1mlTrizol中，充分混合裂解。样品总体积不要超过所用Trizol体积的10%。
2、研磨液室温静置5-10min后，加入200μl氯仿，盖紧EP管，置于涡旋振荡器上剧烈震荡15s。然后冰上静置10min。
3、于4℃，10000g离心15min，吸取上层澄清的液体500μl移至另一洁净的EP管内，并加入等体积（500μl）的异丙醇，轻轻混匀后静置10min。
4、于4℃，10000g离心10min去上清。离心后可能在管壁或管底出现胶状白色沉淀物，小心操作，避免沉淀物流失。
5、加入1ml 预冷的75%无水乙醇（DEPC水配置）至EP管内，并用手指轻轻弹起沉淀物，然后4℃，10000g离心5min。
6、小心弃去上清液，于室温静置干燥2-5min，注意不能过分干燥。
7、将RNA溶于20-50μl DEPC水，必要时可55-60℃水浴3-5min。水浴过程中，EP管盖需密闭。 所提RNA可用于后续试验或者保存于-80℃。

注意事项：

1、提取之前，将所需实验物品全部放置于超净台内，并用祛RNA酶水喷洒台面，紫外照射15min。
2、提取过程中均需佩戴口罩和手套操作，并经常更换手套（一次性手套）。
3、提取过程中，超净台周围应尽量避免人员走动，以免RNA酶趁虚而入进入超净台。
4、样品需充分匀浆裂解，否则易造成RNA提取量低。
5、步骤3中，离心管从离心机拿出来的时候要轻巧，以免管内物质震荡导致下层沉淀激起。吸取上清的时候一定要动作轻，切忌吸取太多，少量即可，吸到400-500μl就OK了，再多就容易碰到下层沉淀了。
6、步骤5中，一定把沉淀弹起来，让浮在酒精中，然后放1-2min，让酒精充分接触沉淀，充分溶解有机试剂，然后再离心。但是有时也会使一些杂质沉淀下来。
7、最后一步溶解RNA时一定要充分。组织提取出来的量还是挺大的，一般50μl左右。

接下来还有两期分子生物学小经验与大家分享，敬请期待！