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十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)是一种常用的蛋白电泳。经典SDS-PAGE蛋白电泳凝胶，由两种不同浓度的丙烯酰胺溶液形成的不连续凝胶（浓缩胶和分离胶）。

1、凝胶材质

聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体聚合而成的聚合物，通常与双丙烯酰胺或N,N'-亚甲基双丙烯酰胺结合使用。 交联剂双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺。 聚合是被TEMED催化（N,N,N,N-四甲基乙二胺）的自由基反应-通常由过硫酸铵(APS)引发。在既定温度下，APS和/或TEMED的浓度决定了聚合速率。
蛋白电泳，通常采用30%或30%+(%T)的聚丙烯酰胺凝胶。通过改变基质的百分比来调整孔径大小，从而有效分离不同大小的蛋白。聚丙烯酰胺凝胶的含量与蛋白大小成反比。

分离胶中丙烯酰胺比例和分离蛋白大小的关系

2、变性剂

SDS是一种阴离子去污剂。SDS-PAGE蛋白电泳中,SDS与蛋白质紧密集合,将蛋白质的氢键、疏水键打开,引起蛋白质构想的改变,其所带的电荷与蛋白质有大大的差异,因此消除或掩盖了蛋白质本身的电荷。电泳时的蛋白的迁移率就不在受蛋白质原有的电荷和形状的影响,而只与蛋白质大小有关。

常用SDS-PAGE蛋白电泳分离胶和浓缩胶配置表

凝胶配置试剂

3、电泳缓冲液

经典SDS-PAGE蛋白电泳缓冲体系（Tris Glycine）工作原理：

上层浓缩胶，由较低浓度丙烯酰胺溶液形成（一般丙烯酰胺浓度为4-6%）。浓缩胶体系中的氯离子（Cl-）作为先导离子，以较快的速度向正极迁移。在其后面形成一个电导较低、电位梯度较陡的区域，加快了蛋白质和甘氨酸离子（Gly)的迁移。由于浓缩胶中的pH较低（一般pH=6.8），甘氨酸的负离子效应不明显，作为尾随离子，迁移较慢。所以，进入分离胶之前，蛋白堆积在氯离子、甘氨酸离子之间，有利于提高电泳的分辨率。

进入下层分离胶后，pH升高(分离胶通常pH=8.8)，使甘氨酸解离成负离子效应增加，使甘氨酸的迁移超过蛋白质。另外，由于分离胶中的丙烯酰胺浓度明显高于浓缩胶，一般丙烯酰胺浓度为8-15%。蛋白质便在一个较均一的pH和电压梯度环境中，按其性质分离。在非变性蛋白凝胶电泳中，按荷质比分离蛋白。在SDS-PAGE变性蛋白凝胶电泳，按相对分子质量大小分离蛋白质。

Tris Glycine缓冲体系电泳缓冲液组分

电泳缓冲液配置试剂

除了(Tris-甘氨酸)缓冲系统，聚丙烯凝胶蛋白电泳缓冲系统也衍生出了一系列进化缓冲系统。Tricine缓冲系统中，用Tricine替代了传统Tris-甘氨酸系统中的甘氨酸，使得低分子量蛋白（2-20 kDa）电泳具有更高的分辨率。Tris-醋酸盐凝胶可以用于大分子量蛋白（＜500 kDa）的分离。

4、蛋白染料

考马斯亮蓝R250染料是SDS-PAGE中最常用的蛋白染色之一。蛋白质-染料复合物在549纳米处有的吸收。每个正电荷氨基酸约1.5-3个考马斯亮蓝R250分子将被结合。灵敏度在200-400ng左右。而考马斯亮蓝G250主要应用是Bradford法(测定蛋白质浓度)，但也可以对聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质进行染色。

蛋白染料

5、上样缓冲液

上样缓冲液通常包含密度成分、SDS、染料、缓冲体系。密度成分帮助样品沉入凝胶孔中，SDS是一种阴离子去污剂，染料则用于指示电泳的进展。对于还原蛋白电泳，还需在上样缓冲液中加入还原剂，降低二硫键的生成。

上样缓冲液组分