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发布人:上海阿拉丁生化科技股份有限公司
发布日期:2020/5/13 16:56:17
琼脂糖和聚丙烯酰胺是核酸电泳中最常用的两种凝胶基质。两种材料都能形成三维基质,用于核酸的分离。
凝胶材质的选择,主要取决于核酸样品的大小和期望达到的分辨率。琼脂糖凝胶可用于分离0.05-50kb的核酸分子。聚丙烯酰胺形成的孔径较小,可用于分离小于3kb的核酸分子。 某些情况下,可采用聚丙烯酰胺凝胶以获得片段小于100bp的单碱基分辨率。
琼脂糖凝胶和聚丙烯凝胶之间的差异
琼脂糖溶液加热并冷却后,就会形成凝胶基质,用于核酸电泳。由于琼脂糖凝胶加热可逆,因此,通过溶解含有目的片段的凝胶,可提取电泳分离出的核酸。
* 确定琼脂糖比例
通过改变基质的百分比来调整孔径大小,从而有效分离不同大小的核酸。琼脂糖凝胶的含量与分离核酸大小成反比。
推荐百分比琼脂糖凝胶用于DNA片段分离
凝胶比例计算为:凝胶%(w/v)=(琼脂糖g/缓冲液ml)x 100%
* 用于核酸电泳的琼脂糖选型:
生化级琼脂糖适用于普通核酸电泳;
Wide range琼脂糖可用于分离碱基数量较低的DNA,约50-1000bp;
低熔点琼脂糖适用于DNA提取,也是凝胶内酶反应的理想选择;
低EEO琼脂糖,纯度更高,有助于和加快核酸条带电泳速度、减少条带扩散并提高电泳分辨率;
高分辨率琼脂糖可用于分离碱基数量差异在2%左右的小DNA片段(20-800bp)。
琼脂糖
聚丙烯酰胺是由丙烯酰胺单体聚合而成的聚合物,通常与双丙烯酰胺或N,N'-亚甲基双丙烯酰胺结合使用。 交联剂双丙烯酰胺含有两个单位通过亚甲基桥连的丙烯酰胺。 聚合是被TEMED催化(N,N,N,N-四甲基乙二胺)的自由基反应-通常由过硫酸铵(APS)引发。在既定温度下,APS和/或TEMED的浓度决定了聚合速率。
* 聚丙烯酰胺组分选型
核酸分离,通常采用 3–30% (%T)的聚丙烯酰胺凝胶。
%T(w/v)=[(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g/缓冲液ml]x 100%
%C(w/w)=[双丙烯酰胺g/(丙烯酰胺+双丙烯酰胺)g]x 100%
聚丙烯酰胺常用组分及应用
* 确定聚丙烯酰胺比例
在凝胶中,丙烯酰胺和双丙烯酰胺(简称为“bis”)的总浓度(以%T表示)决定了孔隙大小。%T百分比越高,孔隙越小,可分辨的分子越小。
不同浓度丙烯酰胺和DNA的有效分离范围表
* 确定配方(以50ml体系为例:)
丙烯酰胺:双丙烯酰胺的组分-可预先制备成原液,方便使用。
丙烯酰胺:双丙烯酰胺为神经毒素,实验时应使用防护设施,小心操作。
聚丙烯酰胺凝胶组分
电泳缓冲液和凝胶制备缓冲液应尽量相同,确保有效的导电性。
电泳缓冲液的选择取决于样品大小、运行时间和后电泳过程,其中Tris-醋酸盐EDTA(TAE)和Tris-硼酸 EDTA(TBE)是最常用的两种缓冲液。
缓冲液选择指南
▪可更好地分离大片段
▪缓冲能力低;更适用于短时间运行
▪适合于下游的酶学应用
检测dsDNA和RNA,一般在变性琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶的条件下进行。在缓冲液中加入变性剂会破坏核酸之间的氢键,减少二级结构的生成。常见的变性剂有:琼脂糖凝胶,磷酸钠缓冲液中的乙二醛和DMSO、NaOH- EDTA缓冲液、MOPS缓冲液中的甲醛或甲酰胺等;聚丙烯酰胺凝胶,TBE缓冲液中的尿素。
生物缓冲液
常见变性剂
核酸样品染色的两种常用方法,包括:1)凝胶内染色;2)电泳后染色。
凝胶内与电泳后染色的利弊
使用荧光核酸染色剂,是核酸内染色的常用方法。可在琼脂糖凝胶制备时加入推荐浓度核酸染色剂(常用溴化乙锭0.5 μg/mL)。
荧光核酸染色剂
电泳后染色常用银染方法对聚丙烯酰胺凝胶进行染色。
常规步骤如下:
(1)取下凝胶放入染色盒中用蒸馏水冲洗2次;
(2)固定:将胶放于固定液中振荡,固定10min;
(3)氧化:倒出固定液,水洗后用1%硝酸氧化3min,用蒸馏水漂洗2次,每次2s;
(4)染色:放入银染液中避光染色30min;
(5)洗涤:蒸馏水漂洗15s;
(6)显色:放入显色液中显色;
(7〕停显:待有清晰条带出现(背景不太深时)倒出显色液,加入10%乙酸终止显色;
(8)水洗,成像。
固定液、染色液、显色液成分:
固定液:10%乙醇,0.5%乙酸
银染液:0.2%硝酸银,用之前加200ul甲醛(250ml银染液中)
显色液:1.5%氢氧化钠,0.5%甲醛
银染相关试剂
上样缓冲液通常包含密度成分、盐、金属螯合剂、染料。密度成分帮助样品沉入凝胶孔中,金属螯合剂,螯合样品中的核酸酶,防止核酸的讲解,染料指示用于电泳的进展。
琼脂糖凝胶中,溴酚蓝和二甲苯青FF的表观分子大小
聚丙烯酰胺凝胶中,溴酚蓝和二甲苯青FF的表观分子大小
Loading Buffer 常见组分举例:
10 mM Tris-HCl (pH 7.6)
60 mM EDTA
0.03% 溴酚蓝
60% 甘油
Loading Buffer 常见组分
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