胰蛋白酶抑制剂

胰蛋白酶抑制剂（Trypsin inhibitor，TI）是抑制胰蛋白酶的丝氨酸蛋白酶抑制剂，是大豆中主要的一类抗营养因子，它对植物本身具有保护作用，可防止大豆籽粒自身发生分解代谢。大豆胰蛋白酶抑制剂是一种多肽类或是蛋白质，根据氨基酸残基组成及差异性质被分为不同种类。目前从大豆中被分解出且研究较多的胰蛋白酶抑制剂主要有两种，分别为Kunitz型胰蛋白酶抑制剂（KTI）和Bowman-Birk型胰蛋白酶抑制剂（BBI）。

KTI由181个氨基酸组成(图1)，含有四个半胱氨酸，相互形成两个二硫键，反应中心位于63号精氨酸与64号异亮氨酸之间，KTI主要对胰蛋白酶起到特异性的抑制作用，是主要的胰蛋白酶抑制因子。

BBI含有大量的半胱氨酸，其显著特点是具有两个独立的反应中心（图2黑色部分），一个位于第16号赖氨酸与第17号丝氨酸之间，特异性与胰蛋白酶结合；另一个位于第43号亮氨酸与第44号丝氨酸之间，特异性与糜蛋白酶结合。因此BBI能够同时抑制胰蛋白酶和糜蛋白酶活性。BBI结构非常稳定，不易通过加热破坏。 1. 热处理  热处理效果受到大豆品种、含水量、加热温度等因素影响。加热不足达不到破坏胰蛋白酶抑制剂活性的目的，而加热过度会使氨基酸，特别是赖氨酸、精氨酸和胱氨酸等受到破坏，还会使多种氨基酸如蛋氨酸、异亮氨酸和赖氨酸等消化率降低。
2. 化学处理  化学处理一般都是利用化学物质破坏胰蛋白酶抑制剂的二硫键，从而改变胰蛋白酶抑制剂的分子结构达到灭活的目的。主要采用的化学物质有亚硫酸钠、偏重亚硫酸钠、硫酸亚铁以及一些带有硫醇基的化合物。但用化学法处理后会存在试剂残留，对原料有不良影响。
3. 超声波处理  在超声波场的作用下，使胰蛋白酶抑制剂的分子结构发生改变，从而影响其活性。但是超声设备成本较高，不适合小规模生产厂家使用。同时，产生振动也会导致一部分蛋白质变性，降低整体营养价值。
4. 生物处理  较为常见的生物处理有微生物发酵法和酶解法。某些微生物（如乳酸菌、枯草芽孢杆菌等）产生的特异性酶对大豆中的胰蛋白酶抑制剂有一定的灭活效果，通过微生物发酵可以降低大豆中胰蛋白酶抑制剂活性。胰蛋白酶抑制剂本身是一种蛋白质，因此也可以通过蛋白酶酶解使其失活。酶解法相对于其他处理方法来说成本较低，且酶是一种天然产物，安全性高，不会对人体或动物健康造成不良影响，使用酶进行处理可以确保产品的安全性和可靠性。 本品是从牛胰、肺、腮等组织中提取的激肽释放酶抑制剂，本身不是酶，由58个氨基酸残基组成的碱性多肽，整个分子呈梨形，活性中心为赖氨酸。它能与多种蛋白酶的活动中心竞争一个赖氨酰基而抑制其活动。
本品为白色或微黄色粉末，无臭，溶于水，有可透析性，等电点为10-10.5。对高温、酸、碱和酶都很稳定。在稀酸中加热至100℃，pH12.6时室温放置24h仍稳定，但pH12.8时活力开始下降。在60-80℃能被嗜热蛋白酶消化，其他酶不能使其失活。 蛋白酶抑制剂。抑制胰蛋白酶，间接抑制糜蛋白酶、弹性蛋白酶、羧基肽酶。不良反应和禁忌：少数人可发生过敏反应，出现红斑、荨麻疹、支气管痉挛，应停药。静脉注射过慢偶可引起呕吐、恶心、腹泻、肌痛、血压变化。 血纤维蛋白；血纤维蛋白原无降解鉴定试验 方法一、牛肺为原料
提取、盐析 将新鲜或冰冻牛肺绞碎后，用5倍量水搅匀，2.5mol/L硫酸调节pH为2，搅拌提取8h，过滤，滤渣同法再提取1次，合并两次提取液，每升加硫酸铵277g，用5mol/L硫酸调pH为1.5，放置过夜。
新鲜牛肺（或冰冻[水, H2SO4]→[pH2, 8h]提取液[(NH4)2SO4]→[pH1.5]盐析物
去杂蛋白 将盐析物除去上清液，过滤，滤液用氢氧化钠液调pH至5.5，再每升加硫酸铵255g，搅匀后静置48h，过滤，得盐析物。用9倍量水溶解盐析物，搅拌2h后，置冰箱过夜，过滤，滤液中加入1/20量的三氯乙酸 (50%)，速加热至80℃后，即冷却至30℃以下，过滤。
盐析物[(NH4)2SO4]→[pH5.5, 48h]盐析物[三氯乙酸]→[先80℃, 后30℃]滤液
盐析、溶解、盐析 滤液用氢氧化钠(5mol/L)调pH为3，按每升加入硫酸铵610g搅拌使溶解，静置过夜。取沉淀物，用4倍量新配制的pH5.5的 0.1mol/L乙酸钠缓冲液和1倍量0.4mol/L硼酸缓冲液溶解，按每升加入硫酸镁 1050g溶解，过夜，次日过滤，析出盐析物。
滤液[NaOH, (NH4)2SO4]→[pH3]沉淀物[NaAc,硼酸缓冲液，MgSO4]→[pH5.5]盐析物
透析、脱盐、沉淀 加4倍量水使盐析出物溶解，用流动自来水于10℃以下透析24h，加硅藻土过滤，滤液用强碱性季铵I型阴离子交换树脂201×7与强酸性苯乙烯系阳离子交换树脂001×7(按201×7树脂：001×7树脂=3:1的比例)搅拌吸附20min，至无硫酸根离子。将树脂滤过，脱盐液(pH7左右)加0.9%氯化钠和1.5倍量丙酮析出沉淀，过滤，滤液再加4倍量丙酮析出沉淀，过夜。然后沉淀用丙酮、乙醚洗涤，干燥。
盐析物[水]→[10℃以下]滤液[阴离子、阳离子树脂]→脱盐液[NaCl, 丙酮]→[pH7]沉淀物
去热原、沉淀、干燥 沉淀物用60倍量80%甲醇溶液溶解，于冰浴搅拌2h，过滤，按滤液体积的1%加30%的氯化钠溶液和5倍量丙酮，沉淀过夜，离心，用丙酮洗涤，干燥，得沉淀物。再用60倍量无热原水溶解，5mol/L氢氧化钠调节pH至11，置冰箱中4d，过滤，滤液用冰醋酸调为pH 4-5后，加入1%量的300g/L氯化钠溶液和5倍量丙酮，析出沉淀，过夜，用丙酮、乙醚洗涤，干燥，即得成品。
沉淀物[蒸馏水，NaOH]→[pH11]无热原液[冰HAc, NaCl, 丙酮]→[pH4-5]成品
方法二、以人尿为原料的人尿胰蛋白酶抑制剂(UTI)提取法
原料处理、酸化 取新鲜男性尿100L<操作全过程在0-4℃下进行)，经双层纱布过滤，用1mol/L NaOH液调节pH至8.5，得白色絮状沉淀物，静置2h，弃去沉淀得上清液，搅拌下缓缓滴加1mol/L HCl调pH4.0，生成细微沉淀，离心20min，除沉淀得酸化尿液。
男性人尿[1mol/L NaOH]→[pH8.5]上清液[1mol/L HCl]→[pH4.0]酸化尿液
吸附、洗脱 取Polyerde Ⅳ500g加入酸化尿液中，搅拌吸附2h，过滤，弃去滤液，吸附剂用常水洗涤至白色，再用2 mol/L NH4HCO3液4L进行洗脱，收集洗脱液。
酸化尿液[Polyerde IV]→吸附物[2 mol/L NH4HCO3]→洗脱液
盐析、透析、浓缩、干燥 将固体(NH4)2SO4加入洗脱液中，达80%饱和度，于4℃下静置4-5h，离心30min，收集沉淀，再将沉淀溶于适量的蒸馏水中，加磷酸盐缓冲液透析至盐除尽，得透析液。将透析液浓缩，冷冻干燥，即得UTI成品。
洗脱液[(NH4)2SO4, 磷酸盐缓冲液]→[4℃, 蒸馏水]透析液[（浓缩，冷冻）]→UTI成品。