NMY51感受态细胞

DUAL membrane系统是DUAL systems BioTech公司开发的专门筛选跨膜蛋白间相互作用的检测技术，它利用分离的泛素系统 (split-ubiquitin)直接检测天然状态下膜蛋白间的相互作用，是目前市面上唯一检测膜蛋白间相互作用的酵母双杂系统。此系统采用NMY51酵母菌株，可直接转化质粒进行蛋白互作验证或筛库试验；此菌株Transformation marker为：trp1，leu2-3，报告基因为：HIS3，ADE2和 lacZ，第一步通过营养缺陷型报告基因 (HIS3，ADE2)进行选择性生长筛选，进一步通过 LacZ报告基因进行β-半乳糖分析显色的定量或半定量筛选，三个独立的报告基因，受不同启动子的调控，降低假阳性几率。 泛素 (ubiquitin)分子量很小，由 76 aa残基组成；泛素作为降解信号分子，可以连接另外一种蛋白质的 N端，然后被泛素专一性蛋白酶 (UBPs)识别，从而导致与泛素相连的蛋白被酶解。泛素可以人为分成两部分：N端 (Nub)，C端 (Cub)。首先，人为地将泛素 Nub的 3位异亮氨酸突变为甘氨酸 (NubI 突变为 NubG)。这样与 Cub的亲合力大大降低，避免了 Cub和 Nub自我结合或接近的可能性。其次，将Cub部分与人工合成的 LexA-VP16转录激活因子融合成一个融合蛋白Cub-LexA-VP16。正常条件下 NubG不与Cub 结合，UBPs也不能识别分离的泛素，转录激活因子也不会被切下来。最后，将要检测的蛋白质分别与NubG和Cub融合，形成 bait融合蛋 (bait-cub-LexA-VP16)和 prey融合蛋白 (prey-NubG)。如果 bait和 prey发生相互作用，就会促使 NubG和 Cub的相互接近，被 UBPs识别，导致 LexA-VP16的解离，进入核内，从而激活报告基因的转录。 此系统可使用四种Bait质粒：pBT3-N，pBT3-SUC，pBT3-STE，pBT3-C，筛选标志均为LEU；三种Prey质粒：pPR3-C ，pPR3-SUC，pPR3-STE，筛选标志均为TRP。