组织/细胞MICRORNA提取试剂盒

本试剂盒采用独特的裂解液/β-巯基乙醇迅速裂解细胞和灭活细胞RNA酶，强烈有机抽提去除蛋白和DNA，RNA包括微小分子RNA吸附于离心柱内特殊硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗、离心的步骤，漂洗液将细胞代谢物、蛋白等杂质进一步去除，最后低盐的洗脱液将纯净RNA从硅基质膜上洗脱。 使用该试剂盒提取的RNA中，长度在15～200nt范围的RNA在95%以上，基本不含有大RNA和DNA。使用该试剂通过一步上柱即可获得高纯度小RNA，可在45分钟内完成miRNA的提取。该试剂盒广泛适用于动物组织、细胞和多糖多酚含量不高的植物组织样本。 miRNA Reagent A溶液中含有胍盐，其具有强烈的腐蚀性，试验时请务必佩戴防护眼镜、手套、口罩等防护措施，如有皮肤接触请立即用大量清水冲洗，再另行就医。 一、组织样本提取
1．向1.5ml EP管中加入300μl miRNA Reagent A。植物组织则再加入10μl β-巯基乙醇，混合均匀。 2．在液氮条件下充分将组织研磨粉碎，将一定的样品量（见样本使用量表）研磨成粉状的组织加入到上述300μl miRNAReagent A中，立即手腕用力震荡至组织粉末彻底溶解于裂解液中。室温静置 5分钟 以充分裂解细胞。   注意：将组织加入到 miRNA Reagent A 后要迅速将组织震散，否则易引起组织成团状，不容易裂解。如发生成团状，务必用移液器将团状组织吹打松散。 3．向上述裂解完毕的裂解液中加入350μl miRNA Reagent B，上下颠倒混合均匀。13000rpm离心5分钟，吸取550μl上清液，转移到新的1.5ml EP管中。 4．向上述溶液中加入200μl无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置 5分钟。 5．13000rpm离心10分钟，转移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。 6．向上述溶液中加入300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。 7．分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。 8．向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。 9．向吸附柱中加入500μl无水乙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。 10．吸附柱 13000rpm 空离心2分钟，去掉残留的乙醇。 11．将吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室温放置 2分钟，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl RnaseFree TEBuffer，室温静置 2分钟，13000rpm离心2分钟，洗脱产物即为提取的miRNA。（通常取1～2μl该产物，即可使用我司一步法 miRNA 反转录试剂盒进行反转录反应，货号：MT0006）。
二、细胞样本提取
1．贴壁细胞：胰酶消化细胞后，离心收集细胞沉淀。用100μl的1×PBS 重悬细胞后，加入300μl miRNA Reagent A颠倒混合均匀，室温放置 5分钟。 2．悬浮细胞：直接离心后，收集细胞沉淀。用100μl 1×PBS重悬细胞后，加入300μl miRNA Reagent A颠倒混合均匀，室温放置 5分钟。 3．向上述裂解完毕的裂解液中加入250μl miRNA ReagentB，上下颠倒混合均匀。13000rpm离心5分钟，吸取550μl上清液，转移到新的1.5ml EP管中。   注意：加入细胞体积数与miRNA Reagent B总体积数为350μl。如加入50μl细胞，则miRNA Reagent B使用300μl。 4．向上述550μl上清溶液中加入200μl无水乙醇，手腕用力震荡数次，室温放置 5分钟。 5．13000rpm离心10分钟，转移700μl上清液到新的1.5ml EP管中。 6．向上述溶液中加入300μl 异丙醇，手腕用力上下颠倒数次。 7．分两次将上述溶液倒入到 miRNA 吸附柱中，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。 8．向吸附柱中加入700μl 75%异丙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。 9．向吸附柱中加入500μl无水乙醇洗涤一次，13000rpm离心1分钟，倒掉过滤液。 10．吸附柱 13000rpm 空离心2分钟，去掉残留的乙醇。 11．将吸附柱放入到新 1.5ml EP管中，室温放置 2分钟，使残留乙醇挥发。在吸附柱滤芯上加入30μl RnaseFree TEBuffer，室温静置 2分钟，13000rpm离心2分钟，洗脱产物即为提取的miRNA。