PKC蛋白激酶活性检测

蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）是G蛋白偶联受体系统中的效应物, 在非活性状态下是水溶性的，游离存在于胞质溶胶中，激活后成为膜结合的酶。蛋白激酶C的激活是脂依赖性的，需要膜脂DAG的存在，同时又是Ca2+依赖性的，需要胞质溶胶中Ca2+浓度的升高。当DAG在质膜中出现时，胞质溶胶中的蛋白激酶C被结合到质膜上，然后在Ca2+的作用下被激活。同蛋白激酶A一样,蛋白激酶C属于多功能丝氨酸和苏氨酸激酶。蛋白激酶C是一种细胞质酶，在未受刺激的细胞中，PKC主要分布在细胞质中， 呈非活性构象。一旦有第二信使的存在，PKC将成为膜结合的酶，它能激活细胞质中的酶，参与生化反应的调控， 同时也能作用于细胞核中的转录因子， 参与基因表达的调控， 是一种多功能的酶。 分离 PKC 蛋白（磷酸化蛋白及非磷酸化蛋白），利用试剂盒组分将 2 种蛋白分离并加以区分，利用电泳琼脂糖凝胶技术显示 2 种不同的蛋白，利用分析软件将显示的不同蛋白定量并加以比较，以磷酸化 PKC 非磷酸化 PKC 灰度值 IOD 的比值显示 PKC 活性（PKC 活化度）。 1、组织样本； 2、培养细胞； 3、血细胞样本； 4、血清、血浆或细胞培养上清液； 5、各种体液。 1．用预冷的匀浆器把细胞匀浆。 2．在 4℃，用 14,000 × g 离心裂解液 5 分钟，保存上清。 3．用 PKC 抽提液预平衡 1ml 的 DEAE 纤维素柱，再把第 2 步中得到的上清过柱。用 5ml 的 PKC 抽提液洗柱子，然后用 5ml 含有 200mM NaCl 的 PKC 抽提液洗脱含有 PKC 的组分。 4．用 PKC 稀释液（PKC dilution buffer）将少量蛋白激酶 C（Promtein Kinase C）稀释到 2.5ug/ml。随试剂盒所附的产品信息中标有这个酶的初始浓度。 5．用探头超声波破碎仪超声处理 PKC Activator Solution 20-30 秒，或直到溶液变温暖。 6．对每一个样品，按照下面所列顺序在 0.5ml 小离心管中混合 PepTag® PKC 5× Buffer,PepTag® C1 Peptide，超声过的 PKC Activator 5X Solution，和水。在样品加入之前，小离心管一直要放在冰上。阴性对照将用于对反应进行定量时确定其摩尔吸收值。 组织样本：加入蛋白保护剂后加冰袋运输，或以干冰运输。
细胞样本：加入蛋白保护剂后加冰袋运输，或以干冰运输；也可直接寄送培养瓶，但培养瓶需密封，并防止污染、破损、漏液。
血清、血浆、上清液：以冰袋运输。
体液：干冰运输