高纯质粒小提试剂盒的应用

背景^[1-4]

高纯质粒小提试剂盒用于高纯度质粒DNA的小量制备与纯化。菌体经碱裂解、高盐、低pH处理，质粒可从菌体中释放出来，并特异、高效地被离心柱硅胶膜（Spin Columns PA）吸附。通过去蛋白液（Buffer PD）和漂洗液（Buffer PW）的清洗可去除蛋白及其他杂质，在低盐、高pH条件下洗脱，最后得到高纯度的质粒DNA。

使用本试剂盒可从1~5 ml过夜培养的菌液中纯化得到高达20 ug的高纯度质粒DNA，可在30 min之内完成提取任务。所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。

产品特点：

1.快速：步骤少，操作简便，节约时间。

2.简便：离心吸附柱不需要预平衡，漂洗液Buffer PW和去蛋白液Buffer PD不需要另加乙醇，即开即用。

3.纯度高：所得质粒可直接用于酶切、转化、PCR、测序、低敏感细胞株的转染等各种常规分子生物学操作。

操作步骤

1.取1-5 ml过夜培养的菌液，室温12,000 rpm离心1 min，尽量将上清去除干净。

2.加入250 ul Buffer P1，用枪头充分吹打使菌体重悬均匀。

3.加入250 ul Buffer P2，温和颠倒混匀6-8次，直到溶液变得清亮粘稠。

4.加入350 ul Buffer P3，立即温和颠倒混匀6-8次，可见白色沉淀物产生，室温静置2 min，然后12,000 rpm离心3-5 min。

5.小心将上清液转移到离心吸附柱Spin Columns PA中，静置2 min，让质粒DNA与吸附柱中的硅胶膜充分结合。12,000 rpm离心0.5-1 min，弃收集管中的废液。

6.向吸附柱中加入500 ul去蛋白液，12,000 rpm离心1 min，弃收集管中废液。

7.加入500 ul的Buffer PW，室温12,000 rpm离心0.5-1 min，弃收集管中废液。

8.重复步骤7一次。

9.室温12,000 rpm离心2 min，甩干残留液体。

10.将离心吸附柱Spin Columns PA置于一个新的1.5 ml塑料离心管（自备）中，加入50-100 ul的Buffer EB，室温放置2 min。12,000 rpm离心1 min，离心管底溶液即质粒DNA。

应用^[5]

可用于质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1的发现研究：

将黏菌素耐药性质粒(p HNSHP45)转移到受体菌中,接合频率高达10-1~10-3,且p HNSHP45质粒能通过接合或转化转入肺炎克雷伯菌中,并介导黏菌素耐药。通过高通量测序获得该质粒全序列,发现该质粒全长为62105bp,其G+C为43.0%,具有典型的Inc I2型质粒骨架,并发现一个1626bp的开放阅读框与插入序列ISAp I1相连,推测此为该质粒从外源获得的序列,该基因被命名为mcr-1。

氨基酸序列分析结果显示MCR-1与磷酸乙醇胺转移酶有60%左右的相似性,细菌脂质A的ESI-MS分析结果证实了MCR-1功能,即通过修饰细菌细胞膜上的脂质A而介导对黏菌素耐药。对原菌SHP45和接合子进行传代实验,采用S1-PFGE和杂交的方法检测该质粒的稳定性,分别在含黏菌素和不含黏菌素的LB溶液传代培养14代,发现质粒p HNSHP45仍能够稳定地存在接合子和原菌SHP45中。

首次发现了质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1,mcr-1位于接合性Inc I2型质粒上,与插入序列ISAp I1相连。MCR-1属于磷酸乙醇胺转移酶,通过修饰细菌细胞膜上脂质A而介导对黏菌素的耐药。mcr-1基因已在食品动物和动物性食品大肠杆菌中广泛传播,且该基因位于接合性质粒上,极易传播扩散,从分子机制上解释了目前国内多粘菌素耐药性迅速升高的原因,为正确评估多粘菌素药物在动物中的使用提供依据。

参考文献

[1]Investigation of a plasmid genome database for colistin-resistance gene mcr-1[J].Satowa Suzuki,Mamoru Ohnishi,Michiko Kawanishi,Masato Akiba,Makoto Kuroda.The Lancet Infectious Diseases.2016(3)

[2]Colistin resistance gene mcr-1 and pHNSHP45 plasmid in human isolates of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae[J].Nicole Stoesser,Amy J Mathers,Catrin E Moore,Nicholas PJ Day,Derrick W Crook.The Lancet Infectious Diseases.2016(3)

[3]Carbapenem-resistant and colistin-resistant Escherichia coli co-producing NDM-9 and MCR-1[J].Xu Yao,Yohei Doi,Li Zeng,Luchao Lv,Jian-Hua Liu.The Lancet Infectious Diseases.2016(3)

[4]Possible genetic events producing colistin resistance gene mcr-1[J].Mauro Petrillo,Alexander Angers-Loustau,Joachim Kreysa.The Lancet Infectious Diseases.2016(3)

[5]刘艺云.质粒介导的黏菌素耐药基因mcr-1的发现[D].华南农业大学,2016.