去甲金霉素的制备

背景及概述^[1][2]

去甲金霉素，主要用于米诺环素和替加环素的生产。其抗菌性较强，抗菌谱与金霉素相似，其作用比四环素、土霉素强，比金霉素稳定，当前生物医药领域中重要的原料产品，但当前在进行去甲金霉素生产过程中，由于国外对我国长期的技术封锁，从而导致我国去甲金霉素产品生产工作相对滞后，缺乏高效可靠，且成本低廉的去甲金霉素产品生产工艺。

而在去甲金霉素产品生产环节中，去甲金霉素菌株培育及筛选是确保去甲金霉素产品生产效率质量的重要基础，而当前在进行对去甲金霉素菌株培育和筛选作业时，所采用的方法和工艺往往均为借鉴同类或相似菌种培育及筛选方法开展，虽然一定程度可以满足去甲金霉素菌株培育及筛选的需要，但工作效率低下，成本相对较高，易产生大量的污染性废弃物，且菌株培育质量稳定性和筛选精度均相对较差，严重影响了甲金霉素产品的产量和质量。

理化性质^[1]

去甲金霉素，别名地美环素、去甲基氯四环素等，是由金色链霉菌发酵产生的四环素类抗生素，用于原料药其抗菌谱与金霉素相似，抗菌效果比四环素强，比金霉素稳定。随着衍生物米诺环素和替加环素相继上市和其他衍生物的持续开发，去甲金霉素的市场前景越来越广阔。

传统的去甲金霉素发酵生产提取方法是将去甲金霉素发酵液进行预处理、板框后滤、滤液使用醋酸丁酯和丁醇进行萃取，然后使用盐酸反萃取浓缩再结晶、烘干得到去甲金霉素盐酸盐，传统工艺使用大量的醋酸丁酯和丁醇，且二溶剂均具有很高的水溶性，故而三废排放严重，环境处理成本大增；且由于发酵液的复杂性和有机溶剂萃取局限性，造成萃取困难，产品质量和收率均受到不同影响。

制备^[2]

一种高效去甲金霉素菌株培育及筛选方法：

步，配置培养母液，首先根据使用需要，在培养釜中配置去甲金霉素菌株培养母液，然后在10分钟内，将去甲金霉素菌株培养母液匀速升温至25℃并保温，然后对去甲金霉素菌株培养母液进行30分钟超声波乳化作业，并在完成超声波乳化作业后对去甲金霉素菌株培养母液保温静置10分钟，然后将配制好的培养母液分为三部分，并分别承载在三个相互独立的反应釜中，同时在其中一部分培养母液中添加生物标记物，然后超声波混合3分钟，制备得到生物标记液；

第二步，菌种接种，首先在无菌环境避光条件下，对培养皿和过承载架进行辐照灭活处理，然后通过菌种接种装置将去甲金霉素菌种均与涂布在若干培养皿上表面，让后将各培养皿通过承载架沿竖直方向进行交错固定，且各培养皿上表面均与水平面平行分布，即可完成菌种接种；

第三步，菌种培育，将完成接种后的培养皿和承载架一同浸入到步中分离开的其中一部分培养母液中，并使培养皿和承载架上端面低于培养母液液面5毫米，然后在25℃恒温环境下培育2天，即可得到将去甲金霉素菌株；且培育过程中，3小时/次的频率对培养母液进行超声波搅拌，且超声波搅拌频率为0.2MHz，每次超声波振荡时间为20分钟；

第四步，荧光标记，完成第三步作业后，将培养釜中用于浸泡培养皿和承载架的培养母液排空，并选择各培养皿中的其中一个为标的培养皿，然后将步配置的培养母液中的另一部分培养母液喷淋到标的培养皿外的各培养皿中，将生物标记液喷淋到标的培养皿中，且培养母液与生物标记液喷淋参数保持一致条件下，以5次/10小时的频率进行均匀喷淋至标的培养皿外的各培养皿和标的培养皿中，并在25℃恒温环境下持续培育5天，且培育过程中，培养皿上端面的培养母液液面高出培养皿上端面的将去甲金霉素菌种上端面1毫米，并在每次完成培养母液喷淋后，对各培养皿进行100r/min振荡条件下持续匀速振荡10分钟，且振荡时培养面上端面与水平面间夹角为30°；

第五步，筛选，将经过培育后第四步中标的培养皿中的去甲金霉素菌株进行生物标记物浓度检测，并根据生物标记物浓度分布区域对标的培养皿中去甲金霉素菌株进行划分，然后根据标的培养皿中去甲金霉素菌株进行划分分布结构，依次对剩余各培养皿中菌株进行相同分布结构的划分，从而即可完成不同菌株质量划分筛选作业；

第六步，浓缩提纯，根据第五步划分筛选的结果，对除标的培养皿外的其他培养皿中的同区域内的去甲金霉素菌株进行分类收集汇合，然后将不符合标准的区域内的去甲金霉素菌株进行去除并无害化处理，对各区域内的去甲金霉素菌株的浓度机发育状态分别进行浓缩提纯，并使浓缩提纯后各区域内的去甲金霉素菌株的浓度机发育状态保持一致后进行二次汇合即可得到成品。

提取

将含有6.0g/L去甲金霉素的发酵液35升，调节温度至5-10℃加入0.05wt％亚硫酸钠35g，调节温度至10℃，使用草酸调节pH＝1.5±0.2，搅拌20分钟，使用南京久吾公司陶瓷膜过滤，陶瓷膜通量30升/小时；得滤液70升；

将滤液过122树脂，流速2BV/h，完成后使用pH＝6.8-7.0的饮用水顶洗0.5小时，得脱色液72升；

将脱色液过截留分子量为150道尔顿的美国GE公司有机纳滤膜组件，压力1.5mpa，温度保持5-10℃；得浓缩液4升；

将浓缩液搅拌条件下，调节温度5-8℃，使用0.1M的氨水调节pH＝6.5±0.2，得到沉淀悬浮液，继续搅拌30分钟，静置30分钟，固液分离得去甲金霉素粗品；

将去甲金霉素粗品使用尿素复盐法精制得去甲金霉素成品，烘干得去甲金霉素盐酸盐152g，总收率72.38％；成品送检符合EP、USP标准。

主要参考资料

[1] 林桂真, 叶蕊芳, 程林同, & 毛全贵. (2014). 常压室温等离子体诱变高产去甲金霉素金色链霉菌. 中国医药工业杂志, 45(11).

[2] 苏玉山, 苗勇, 亓平言, 王冰, SuYu-shan, & MiaoYong等. (2000). 去甲金霉素提取新工艺研究. 中国抗生素杂志, 25(5), 341-343.

[3] 李士杭[1], 叶蕊芳[1], 吕和平[2], 毛全贵[2], & 戴维[2]. (2012). 去甲金霉素发酵培养基的优化及机制分析. 中国医药工业杂志, 43(11), 896-902.