酯蟾毒配基

【背景及概况】^[1][2][3]

蟾酥是常用的天然中药组，提取于蟾蜍科动物中华大蟾蜍（Bufo bufo gargarizans Cantor）或黑眶蟾蜍（Bufo melanostictus Schneider）的干燥分泌物，具有多种生物活性，包括镇痛、消炎、麻醉，还有抗癌、抗辐射、强心等，因此在中医学临床治疗中具有重要的价值。由于近年来大量的实验研究证明，蟾酥在临床治疗恶性肿瘤呈现出强大的药理活性，从而引起学界的广泛关注。目前人们围绕着蟾酥的抗癌活性，已分离出多种活性成分，可以通过上调P53 蛋白的表达并提高Bax/Bcl-2 表达比值，诱导骨肉瘤细胞发生凋亡。蟾酥中的主要成分有蟾蜍甾二烯类、强心甾烯蟾毒类、吲哚碱类、醇类及多糖、氨基酸、肽类以及肾上腺素等，其有效成分多为脂溶性成分，其中蟾毒灵（bufalin，BL）、华蟾酥毒基（cinobufagin，CBG）、酯蟾毒配基（resibufogenin，RBG）等占较大比例（约 10%），它们对心血管系统、肿瘤细胞均有显著的药理活性。华蟾素注射液中主要含有酯蟾毒配基，蟾蜍色胺，核苷和多肽四大类活性成分。其中含量仅占百万分之一的酯蟾毒配基类成分已被越来越多的研究证实是该药发挥抗肿瘤作用的有效物质，包括酯蟾毒配基、华蟾酥毒基、蟾毒灵等蟾蜍甾烯类化合物。

酯蟾毒配基作为蟾酥的有效成分之一，推测天然中药单体分子酯蟾毒配基可以通过诱导骨肉瘤细胞发生凋亡，从而抑制其肿瘤细胞的增殖能力。采用MTT实验检测不同浓度酯蟾毒配基处理后的骨肉瘤细胞增殖情况，MTT检测结果显示，酯蟾毒配基在体外水平可以有效抑制骨肉瘤细胞的增殖能力，其对肿瘤增殖能力的影响呈剂量依赖性相关。此外，Western Blotting结果显示酯蟾毒配基可以上调骨肉瘤细胞P53蛋白表达量，该结果提示酯蟾毒配基可能通过触发骨肉瘤细胞发生凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长。

【结构】

【药代动力学】^[2]

分别于大鼠尾 iv 给予蟾酥提取物 0.8 mg/kg 后 2、5、10、15、20、30、45、60、90 min，眼眶取血，采用乙腈沉淀蛋白与液液萃取相结合方法进行血浆样品预处理，以 HPLC 法测定大鼠血浆中蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基的质量浓度，以 Kinetica 软件拟合药动学参数。结果显示蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基均得到很好的分离，重现性、精密度、线性关系良好，达到体内分析要求；经非房室模型拟合，得到蟾毒灵、华蟾酥毒基及酯蟾毒配基在大鼠体内主要药动学参数；iv 给药 30 min 时，血药浓度均降至 Cmax的 1/5 以下。蟾蜍甾烯类成分在大鼠体内代谢较为迅速，具体如下：

【分离纯化】^[4]

1. 上样硅胶的制备：取干蟾皮粗粉（过 2 号筛）250g，加入 10 倍量 80% 的乙醇回流提取 2 次，每次 2 h，回收乙醇至无醇味，浓缩至生药浓度 1 g/mL，加入适量 200～300 目硅胶，蒸干，研磨均匀，60℃ 干燥 1 h。即得上样硅胶。

2. 干蟾皮中酯蟾毒配基RBG、华蟾酥毒基CBG含量测定

1）色谱条件选择：超高效高压液相色谱仪-紫外检测器；色谱柱为BEH phenyl1.7μm，2.1 mm×100 mm column；柱温35℃；流动相为乙腈-水（30∶70）；流速为0.3 m L / min；检测波长为 296 nm。

2）对照溶液的制备：分别精密称取 RBG 对照品 6.06mg、CBG 对照品 6.30 mg，分别加甲醇溶解并定容至 10 mL棕色量瓶。制成 0.606、0.630 mg/mL 的对照品贮备液，再从上述对照品贮备液中分别精密吸取 0.9 mL和1mL，加甲醇定容至100 mL 棕色量瓶中，摇匀，得混合对照品溶液( RBG5.454μg/mL、CBG6.300μg/mL) 。

3）供试品溶液的制备： 取直径为 20 mm×300 mm 的层析柱，称取适量 200～300 目硅胶，湿法装柱。称取上样硅胶，干法上样，以环己烷-氯仿-丙酮( 4∶3∶3) 混合溶液洗脱，收集洗脱溶液，蒸干，甲醇定容，0.22μm 微孔滤膜滤过，弃初滤液，取续滤液，分别测定 RBG，CBG 含量。

4）标准曲线的制备： 取 RBG、CBG 混合对照品溶液，分别进样 0.5、1、2、3、4、5 μL，并测定 3 次。以 RBG、CBG的进样量(μg) 为横坐标，以峰面积为纵坐标绘制标准曲线。得 RBG 回归方程为 y = 2856 882.8877x + 70.504 1，R2= 1.0，CBG 回归方程为 y = 2927858.5200 + 96.213 7，R2= 1.0。结果表明，RBG 在 2.7～27.3μg 范围内线性关系良好，CBG 在 3.2～31.5μg 范围内线性关系良好。

纯化条件径高比为 2∶14，上样量为10g，洗脱溶剂用量为160mL。在 9.32-300μg / mL 浓度范围内。采用该纯化工艺所得 RBG、CBG 总含量为 5.42% ，RSD为2.65%。总转移率为73.09%，RSD 为0.18%，该纯化工艺稳定，方法可行。

【应用】^[1]

酯蟾毒配基的主要药理作用为抗肿瘤。运用现代色谱技术分离华蟾素注射液，得到酯蟾毒配基类成分，采用 HPLC-DAD-FT-ICR-MS 分析并鉴定酯蟾毒配基类化合物的主要单体。通过体外细胞筛选酯蟾毒配基抗肿瘤的活性，在体内建立胰腺癌荷瘤裸鼠模型以评价酯蟾毒配基药效，在体外将分离所得酯蟾毒配基的主要活性单体进行抗胰腺癌活性筛选。结果显示华蟾素注射液中的酯蟾毒配基在体外对肝癌 BEL7402 细胞，胃癌 BGC823 细胞和胰腺癌 SW1990，MIA Pa Ca-2 细胞的半数抑制浓度分别为0.47 ± 0.03，0.06 ± 0.01，0.06 ± 0.02，0.11 ±0.03g/L，酯蟾毒配基的半数致死量为 20 mg/kg，体内对 SW1990 荷瘤裸鼠的治疗效果接近化疗药物吉西他滨，从酯蟾毒配基中分离并鉴定的 12个活性物质体外抗胰腺癌的活性筛选出日蟾毒它灵、沙蟾毒精和嚏根草苷元对 SW1990 和 BxPC-3 细胞具有明显抑制作用。因此酯蟾毒配基在体外对胰腺癌细胞的抑制率与胃癌几乎相同，在体内对胰腺癌荷瘤裸鼠有明显治疗效果，同时酯蟾毒配基中的单体成分日蟾毒它灵、沙蟾毒精和嚏根草苷元在体外对胰腺癌细胞有明显的抑制作用。

【参考文献】

[1] 高波, 魏晓露, 韩玲玉, 等. 华蟾素注射液中酯蟾毒配基的分离及体内外抗肿瘤活性筛选[J]. 中国实验方剂学杂志, 2017 (16): 78-84.

[2] 刘冬 [1, 杜守颖, 何秀峰, 等. 蟾毒灵, 华蟾酥毒基及酯蟾毒配基大鼠体内药动学研究[D]. , 2012.

[3] 于海涛. 酯蟾毒配基抑制骨肉瘤临床前实验研究[D]. 长春中医药大学, 2014.

[4] 唐晓霞, 贾燕丽, 田港, 等. 干蟾皮中酯蟾毒配基和华蟾酥毒基的纯化及其体外抗结肠癌活性的研究[J]. 中华中医药学刊, 2015, 33(9): 2243-2245.