脑磷脂的应用

背景^[1][2]

磷脂类化合物是细胞膜的重要组成成分，具有重要地生理功能。高纯的磷脂分级产品如卵磷脂和脑磷脂可广泛用于营养，医药及化妆品行业。但由于目前的高纯卵磷脂和脑磷脂多采用高效液相色谱(HPLC)淋洗模式制备，产品处理量小，溶剂消耗大，因而生产成本高，价格昂贵，从而限制了其应用。为了降低成本，许多学者进行了研究，如Kim等人尝试着从简化流动相这一角度出发，采用纯甲醇为流动相对蛋黄磷脂进行了分离，取得了一定的效果，但无法从根本上解决淋洗色谱所固有的缺陷。

理化性质^[1]

脑磷脂，又称磷脂酰乙醇胺。在动物体内广泛分布，尤富集于脑和脊髓，在大豆中含量较高，临床上可用做止血药和肝功能检查的试剂。由甘油、脂肪酸、磷酸和乙醇胺组成的一种磷脂。新鲜制品是无色固体，空气中易变为红棕色。有吸湿性。不溶于水和丙酮，微溶于乙醇，溶于氯仿和乙醚。可用作抗氧剂，也用于医疗上。可由家畜屠宰后的新鲜脑或大豆榨油后的副产物中提取而得。

磷脂酰乙醇胺(Phosphatidyl Ethanolamine，简称PE)和磷脂酰胆碱(Phosphatidyl Choline，简称PC)是其中两种重要的磷脂，俗称脑磷脂和卵磷脂，被广泛应用于食品、医药、化妆品等行业。高纯度脑磷脂是良好的天然表面活性剂，具有独特的生物活性和生理功能，无毒、无污染、无刺激，易生物降解而受到国内外科技界和工业界的高度重视，其需求在逐年增加，但目前纯度大于90％的脑磷脂产品我国尚依赖进口，因此开发出适合我国国情的、低成本、高纯度脑磷脂制备方法，具有重要的经济和社会价值。

脑磷脂的精制方法主要有萃取法、柱层析法、沉淀法、膜分离法等。柱层析法由于具有操作简便、分离效果好、不需昂贵设备、处理量大等优点，因而倍受关注。在柱层析法研究中，目前主要集中在价廉的硅胶和氧化铝。

应用^[3]

脑磷脂是良好的天然表面活性剂，具有独特的生物活性和生理功能，无毒、无污染、无刺激，易生物降解而受到国内外科技界和工业界的高度重视，同时脑磷脂作为一种新型的橡胶硫化促进剂和/或防老剂。

制备^[2]

方法一：

新鲜蛋黄先用丙酮脱脂三次，真空抽滤，滤饼用95％酒精提取二次，合并滤液，真空浓缩得到粗磷脂。经HPLC分析，粗磷脂中含PC75.0％(wt％)、PE16.0％(wt％)。取含水量为10％的硅胶用含甲醇10％的二氯甲烷混合溶剂湿法装Ф1/2英寸ID×20厘米柱子(柱体积为25ml)，先用含甲醇10％的二氯甲烷混合溶剂冲洗50ml。进60ml浓度为100mg/ml的粗磷脂溶液(溶剂为含甲醇10％的二氯甲烷溶液)，接着用200ml甲醇冲洗，流速控制在0.4ml/min，加样后开始收集流出液(按每份约5ml收集)。流出液经TLC分析后合并脑磷脂馏份，经真空浓缩、冻干后得脑磷脂0.55g，经HPLC分析产品中脑磷脂的含量为91％。柱子用含氨2％(重量百分比)的甲醇溶液(由含重量百分比为25％的氨水配制)冲洗150ml，再用含甲醇10％的二氯甲烷混合溶剂冲洗100ml后可重新进样，同样冲洗流速控制在0.4ml/min。

大豆脑磷脂的生产方法：

1)乙醇提取，将粉末磷脂置于罐中，按1kg粉末磷脂需17L纯度为96％的乙醇比例投入乙醇，搅拌回流提取50-70min，抽出提取液，提取三次，合并三次提取液；

2)冷藏，将上述提取液置于冷库中，温度为-5--7℃，冷藏不小于12h；三、浓缩，干燥，温度80-90℃，真空度0.1-0.3MPa、时间1-3h，即得成品。

超临界二氧化碳除脂生产水解脑蛋白粉和脑磷脂：

将新鲜或冷冻的动物脑去除脑膜和血管，挤压通过6目筛，平铺于真空干燥箱烘盘上，在真空度为‑0.08 Mpa、温度 45℃,干燥至含水分3%以下，得干燥品，保存于‑5℃备用；将干燥的动物脑粉粒，分批装入HA221‑40‑100型超临界CO2萃取设备的萃取釜中，以萃取釜压力32.5 Mpa，温度41℃；分离釜Ⅰ压力18 Mpa，温度45℃；分离釜Ⅱ压力6Mpa，温度48℃；夹带剂为95%乙醇，用量为脑干燥品的20 %；萃取时间2小时；二氧化碳流量60立升/公斤/小时；取出萃取釜中残留物，用于酶解生产水解脑蛋白粉，取出萃取釜Ⅰ中膏状物，用于提取脑磷脂。萃取釜Ⅱ中膏状物可以去掉；

秤取萃取釜中残留物100公斤，加纯化水3倍，加入动物蛋白水解专用酶，用量0.5 %，开动搅拌机拌均匀，用20 %氢氧化钠调节pH为7.5，温度 65℃±1℃，搅拌酶解3小时；加入风味酶0.16%，在上述pH值和温度条件下继续水解3小时；升温到90℃，灭酶20分钟； 降温到45℃，加活性炭4%，搅拌25分钟，再静置吸附30分钟；板框压滤除去固体杂质，压力0.12Mpa，反复循环直至滤液澄清，经0.45µm微孔滤膜精滤，得精滤液；

按说明书预处理大孔树脂HPD‑200型，取经处理的HPD‑200型大孔树脂70公斤装入玻璃柱；取精滤液过柱，流速2BV/h，当流出1BV时收集过柱液；加完精滤液后以4BV纯化水洗脱精滤液，过柱液与洗脱液合并，经预处理好的阴树脂201×4FC，阳树脂001×4脱盐；收集脱盐液，供浓缩、干燥；以含0.3 %的盐酸纯化水，洗涤大孔树脂HPD‑200,再用纯化水洗至流出液的Ph值为5.0～6.5；接着以含0.4%的氢氧化钠纯化水洗涤大孔树脂，再用纯水洗直至Ph值为7.0～7.5；以1%硫酸铜在碱性条件下检测不到双缩脲反应为止；所述的大孔树脂可以再重复使用；阴树脂201×4FC，阳树脂001×4分别以2.1～5%的氢氧化钠水溶液，3.0～4.5%的盐酸再生；

真空薄膜浓缩脱盐液，真空薄膜浓缩条件为：全程控制在65℃以下，真空度为‑0.09Mpa；浓缩后溶液含固量22～25%；浓缩液喷雾干燥，喷雾干燥条件：喷嘴入口温度170℃；出料口温度50～70℃，得脑蛋白水解粉5公斤；取出分离釜Ⅰ中含脑磷脂类和胆固醇的膏状物，在真空中干燥，真空度为‑0.08 Mpa，温度62℃，干燥4小时，得稠膏；

用4倍体积丙酮，分三次萃取稠膏中胆固醇和油脂类，萃取液与母液分别回收丙酮， 丢弃萃取液回收丙酮后得到的胆固醇和油脂类；在玻璃柱中装入100份层析用硅胶；另取6份硅胶与回收丙酮后等量的母液混合，将混合物加于硅胶柱上部，接着用95%热乙醇6倍, 温度75℃，流速3份/分钟，洗脱硅胶柱，收集脑磷脂乙醇液，真空回收乙醇，真空度为‑0.06 Mpa，温度60℃，直到馏出液没有乙醇味为此；膏状物为脑磷脂，含量≥90%，充氮气密封保存。

主要参考资料

[1] 李卫, 邵友元, & 黄光斗. (2001). 柱层析法分离卵磷脂和脑磷脂. 湖北工业大学学报, 16(2), 63-65.

[2] 张维农, 何海波, 冯钰琦, & 达世禄. (2004). 柱色谱法制备高纯大豆卵磷脂和脑磷脂研究. 中国油脂, 29(6), 54-58.

[3] 杨晓萍, 戴有盛, & 陈华. (1994). 鱼油对小鼠脑磷脂中脂肪酸组成的影响. 营养学报(2), 164-168.