人淋巴成纤维细胞提取物的应用

背景^[1-6]

人淋巴成纤维细胞提取物是从人淋巴成纤维细胞提取的，人淋巴成纤维细胞从正常人淋巴组织制备。人淋巴成纤维细胞提取物可以直接用于基因克隆，表达图谱分析以及各种分子生物学实验的研究。成纤维细胞胞体呈梭型或不规则三角形，中央有卵圆形核，胞质突起，生长时呈放射状。除真正的成纤维细胞外，凡由中胚层间充质起源的组织，如心肌、平滑肌、成骨细胞、血管内皮等常呈本型状态。

另外，凡培养中细胞的形态与成纤维类似时皆可称之为成纤维细胞。体外培养的成纤维细胞多为梭形、多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体。处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达。

它具有较强的分裂增殖能力，适应性强，是最容易培养的动物细胞类型之一。成纤维细胞是疏松结缔组织的主要细胞成分，细胞呈梭形或扁的星状，具有突起。根据不同的功能活动状态，将细胞分为成纤维细胞和纤维细胞二型。

成纤维细胞是功能活动旺盛的细胞，细胞和细胞核较大，轮廓清楚，核仁大而明显，细胞质弱嗜碱性，具明显的蛋白质合成和分泌活动；处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。纤维细胞功能活动不活跃，细胞轮廓不明显，核小着色深，核仁不明显，细胞质少。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。

应用^[7][8]

人淋巴成纤维细胞提取物可用于MEKK2参与和调制T淋巴细胞受体信号转导以及皮质激素对人肺成纤维细胞MAPK的作用研究：

MEKK2参与T细胞受体信号中JNK激活和IL-2基因表达JNK（c-Jun N-terminal kinases）是MAPK（mitogen-activated protein kinase）家族基因的成员，对细胞增殖、分化和凋亡十分重要。以前的研究发现T细胞JNK激活需要T细胞受体和辅助受体如CD28的共刺激。本研究探讨MEKK2是否是T细胞中特异的JNK上游活化激酶，是否涉及转导来自TCR／CD3的T细胞信号激活JNK MAPK级联和T细胞特异基因IL-2的表达。利用多组织poly（A）杂交模板，用1kb N-末端人MEKK2做探针行Northern杂交。

Jurkat T-细胞用电击法转染，COS-1细胞用Lipo-fectamine转染检测不同的基因表达或作用。抗JNK抗体免疫沉淀法，GST-cJun为作用底物体外检测JNK激酶活性；抗HA抗体、GST-JNKK2为作用底物体外检测MEKK2激酶活性。荧光酶报告基因检测IL-2和AP—1基因的表达。抗HA抗体12CA5、抗MEKK2抗体11281129、抗磷酸化抗体Pty20和ECL试剂盒进行蛋白印迹检测。Northern杂交分析显示MEKK2在外周血细胞中有高水平表达。用AP-1报告基因在Jurkat细胞和COS-1细胞检测AP-1的转录活性，结果显示在T细胞MAPK级联中MEKK2位于JNK的上游。全长MEKK2 DNA的表达能导致JNK1强烈激活，而对Erk2没有作用。

MEKK2也是JNK的强烈激活物，能激活JNK依赖的AP-1和IL-2报告基因表达。当用抗CD28抗体刺激时MEKK2介导的JNK活性无变化，而随着抗CD3抗体刺激，MEKK2介导的JNK活性显著增加。说明MEKK2参与抗CD3抗体激活JNK的信号通路。

抗CD3抗体刺激后用抗磷酸化酪氨酸抗体分析MEKK2，发现CD3刺激能够迅速诱导MEKK2酪氨酸磷酸化。抗CD3和抗CD28抗体共刺激诱导的JNK激活能被无功能的MEKK2突变体抑制，而TPA（12-O-tetradecanoylphorbol-13-acetate）和Ca2+激动剂A23187的JNK激活不能被抑制。以上结果显示人MEKK2在TCR／CD3介导的JNK MAPK激活和IL-2基因表达中是一重要信号分子。

参考文献

[1]Co-stimulation-dependent activation of a JNK-kinase in T lymphocytes.Eur J Immunol.1998 Aug;28(8):2320-30.Avraham A,Jung S,Samuels Y,Seger R,Ben-Neriah Y.European Journal of Immunology.1998

[2]The p38 mitogen-activated protein kinase pathway and its role in interferon signaling.Pharmacol Ther.2003 May;98(2):129-42.Posas F,Saito H.Osmotic activation of the hog MAPK pathway via Ste11p MAPKKK:scaffold role of Pbs2p MAPKK.Platanias LC.Science.1997

[3]Control of ras activation.Downward J.Cancer Surveys.1996

[4]Association of mitogen-activated protein kinase with the microtubule cytoskeleton.Reszka AA,Seger R,Diltz CD,Kerbs EG,Fischer EH.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1995

[5]Estensen.1996.Chemopreventive effects of myo-inositol and dexamethasone on benzo[a]pyrene and 4-(methylnitrosoamino)-1-(3-pyridyl)-1-butanone-induced pulmonary carcinogenesis in female A/J mice.Wattenberg,L.W.and R.D.Cancer Research.

[6]Com-plexes between STE5 and components of the pheromone-responinsive mitogen-activated protein kinase module.Marcus S,Polverino A,Barr M,Wiger M.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America.1994

[7]Protein kinase C mediates platelet-derived growth factor-induced tyrosine phosphorylation of p42.Kazlauskas A,Copper JA.The Journal of Cell Biology.1988

[8]郭子建.MEKK2参与和调制T淋巴细胞受体信号转导以及皮质激素对人肺成纤维细胞MAPK的作用[D].中国协和医科大学,2003.