小鼠肝细胞CYP450酶的含量测定

背景及概述^[1]

细胞色素P450（cytochromeP450，CYP450）是主要分布于肝微粒体的药物主要代谢酶，参与脂肪酸、类花生四烯酸等多种内源性物质及药物、毒物、致癌物、前致癌物等外源性化合物的代谢，其主要包括CYP1A2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP2E1、CYP3A4、CYP3A5等，参与70%~80%临床常用药物的代谢。CYP450含量和活性影响药物在体内的代谢消除，其个体差异是导致药物效应差异的主要原因。体内研究多通过CYP450探针药物的体内药动学来反映代谢情况，即将药动学的个体差异归因于药物代谢差异，如CYP450基因多态性影响药物代谢的结论多由此获得。但体内药动学除受代谢影响外，亦受吸收、分布和排泄过程的影响。体外研究多停留在肝微粒体、肝细胞、重组酶等代谢体系中。由于标本数量所限，肝微粒体研究难以涉及CYP450代谢活性的个体差异及影响因素，重组酶难以反映肝脏的实际状况。

含量测定^[1]

小鼠CYP450酶含量的测定：CYP450为血红素蛋白，其还原型与CO结合后，在波长450nm处出现吸收峰，故可通过测定溶液的吸光度值，反映溶液中CYP450酶的含量。实验步骤如下：

1. 分组：先将小鼠逐一称重，按照体重由小到大（或由大到小）排序。根据简化随机原则将小鼠分为3组（甲、乙、丙），每组3只。

2. 腹腔注射给药　甲组为0.75%苯巴比妥钠溶液，乙组为0.002%放线菌素D溶液，丙组为生理盐水。每组小鼠均连续给药3天。

3. 制备肝匀浆　小鼠处死，取出肝脏，注意勿破坏胆囊。称重后，将肝组织置于玻璃匀浆器中，加入预冷后的0.25mol/L蔗糖液（0.5ml/100mg肝组织），冰浴下研磨至淡粉色匀浆。然后4摄氏度下10,000 g离心20 min后，留取上清液。

4. 小鼠肝细胞CYP450酶含量的测定　取离心后上清液1ml，加入预冷后的0.05mol/L Tris-HCl缓冲液9ml，充分混匀。冰浴下通CO气，1~2气泡/s，通气2min。将通气完毕的溶液分为两半，分别置于两个试管中：其一作为测定吸光度时的参照杯，另一加入连二亚硫酸钠5mg，充分混匀，即为待测样品杯。测定并记录样品杯在450nm和490nm波长下的吸光度值（表23-4）。

5. 计算小鼠肝细胞CYP450酶含量

根据公式A = E·C·L，其中A：吸光度；E：490nm到450nm波长的示差光谱消光系数，本实验中E = 104L/cm·mmol；C：CYP450浓度；L：比色杯厚度（光路长度），本实验中比色杯为1cm。因此，得到CYP450（nmol/g肝脏）= [(A450 - A490) / E·L]×50000

6. 小鼠肝细胞CYP450酶的诱导和抑制

（1） CYP P450升高百分率：

[(苯巴比妥组-生理盐水对照组) /生理盐水对照组]×100%

（2） CYP P450降低百分率：

[(生理盐水对照组-放线菌素D组) /生理盐水对照组]×100%

主要参考资料

[1] 人肝人肝细胞CYP450酶含量与活性研究进展