四环素的提纯及残留检测
发布日期:2020/10/18 17:57:03
背景及概述[1][2]
四环素为代四环素类抗生素，其具有广谱抗菌特点，可抵抗如革兰氏阴性和革兰氏阳性菌、衣原体、支原体和原生物类寄生虫等多种微生物。另外对很多青霉素敏感的人群，可以用四环素类抗生素作为替代品治疗某些疾病。由于其造价不高，广泛应用于对人类和动物感染的治疗。
提纯[1]
四环素的提纯方法，其特征在于，包括以下步骤：
1）、四环素粗品的制备：将金色链霉菌孢子在发酵罐内进行发酵培养后加草酸进行酸化处理，过滤得到滤液，滤液在碱性条件下加入钙盐进行沉淀，沉淀物经酸洗后得到四环素粗品；
2）、四环素粗品的干燥：将四环素粗品放置在真空干燥箱中进行干燥，干燥温度为50℃-60℃；
3）、四环素-无机盐溶解液的制备：将干燥后的四环素粗品用无机盐饱和溶液溶解，调节pH值为2-4；即得四环素-无机盐溶解液；
4）、四环素-无机盐溶解液的沉淀：向四环素-无机盐溶解液中滴加氨水调节pH值至3-5，降温至0-10℃，静止1-2小时析出四环素-无机盐沉淀；5）、重结晶-热结晶：将步骤4）得到的四环素-无机盐沉淀在搅拌条件下加入到有机溶剂A中，待全部加入后滴加盐酸，搅拌至四环素-无机盐沉淀全部溶解，升温至50℃-60℃，再慢慢加入有机溶剂B，保温50min-60min，析出四环素精制晶体；
所述有机溶剂A为乙醇、乙二醇、异丙醇、异丁醇、叔丁醇或丙酮；
所述有机溶剂B为乙醚、异丙醚、乙酸乙酯、醋酸乙酯、丙烯酸甲酯或磷酸甲酯；
6）、重结晶-冷结晶：将步骤5）的体系放置在0-10℃的冷水浴进行冷结晶，析出四环素精制晶体，待完全结晶后进行减压抽滤，用机溶剂A洗涤晶体，得到四环素湿晶体；
7）、将步骤6）得到的四环素湿晶体在干燥箱内进行干燥处理得到四环素。
残留检测[2]
快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法，具体包括下述步骤：
1)NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备
分别取Y2O3，Yb2O3和Er2O3，向其中加入过量的HNO3溶液加热反应，溶液蒸发后加入 去离子水定容分别得到浓度分别为1mol/L的YNO3溶液，0.2mol/L的YbNO3溶液和0.02mol/L 的ErNO3溶液；量取YNO3溶液2.5mL、YbNO3溶液3mL和的ErNO3溶液3mL混合均匀，缓慢加入 1mmol的柠檬酸钠溶液后超声后混合均匀；磁力搅拌下缓慢滴加1.0mol/L的NaF溶液直至混 合溶液中有白色沉淀出现，使用NaOH溶液将混合溶液的pH值调为5，磁力搅拌1h后转移至均 相反应器中，180℃保温反应4h，冷却至室温并将混合液离心，离心转速为10000rpm，离心时 间为10min；使用无水乙醇洗涤一次，然后再用双蒸水洗涤三次；洗涤完毕后置于60℃恒温 干燥12h，即得NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
2)功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子的制备：
将20mg NaYF4：Yb，Er粉末加入到30mL的正丙醇溶液，超声磁力搅拌40min，向其中 滴入1.25mL氨水溶液和10mL水，然后转移至35℃的恒温水浴中磁力搅拌1h；向其中缓慢滴 加10μLTEOS溶液和正丙醇的混合溶液，继续反应4h；接着将0.1mL APTES和正丙醇的混合溶 液滴入到上述溶液中，持续搅拌1h；搅拌完毕后10000rpm下离心10min，用无水乙醇洗涤沉 淀物3次；将沉淀物置于60℃干燥12h，即得功能化的NaYF4：Yb，Er纳米粒子；
3)四环素类抗体连接
取20mg功能化的NaYF4：Yb，Er的纳米粒子溶解到5mL 0.01mol/L的PBS中，然后缓 缓加入1.25mL 25％的戊二醛溶液和100mg硼氢化钠，混合均匀室温下缓慢振荡反应1h，混 合溶液在10000rpm下离心10min，使用0.01mol/L的PBS溶液洗涤三次，将沉淀物重新分散在 5mL的0.01mol/L PBS中，加入30μg的四环素类抗体和100mg的硼氢化钠，室温下继续振荡 1h；然后加入100mg的Tris为封闭剂，继续振荡反应1h；所得的产物离心、用PBS溶液洗涤3次 后，重新分散在1mL PBS中，4℃保存备用。
4)合成金纳米
称取0.0216g氯金酸溶于237.5mL去离子水，剧烈搅拌并加热至沸腾；称取0.125g 柠檬酸钠溶于12.5mL去离子水中，在磁力搅拌下将柠檬酸钠溶液快速加入到氯金酸溶液 中，继续水浴中搅拌直至溶液呈现酒红色，继续加热回流30min，冷却到室温得到冷却溶液， 称取0.0042g PVP溶于1mL去离子水中，再将其加入到冷却溶液中，室温搅拌24h，自然冷却 至室温，即得金纳米，4℃避光保存；
5)金纳米和四环素类抗原连接
取5mL金纳米，用pH为9.0的0.01mol/L PBS溶液将其pH值调为8.0，加入20μg的四 环素类抗原，冰水浴中搅拌1h；然后加入25mg的BSA作为封闭剂，继续搅拌1h，4℃离心转速 为10000rpm，离心时间为10min，使用0.01mol/L的PBS洗涤三次，移去上层溶液，最后用5mL 0.01mol/L的pH为7.0的PBS溶液收集，得到四环素类抗原-BSA-金纳米溶液，4℃保存备用；
6)确定以及优化四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳米溶 液为基础的四环素类荧光能量共振转移体系：
取1.5mL的小试管加入定量的游离的四环素类抗原，然后在每个小试管中分别加 入30μg/mL的四环素类抗体偶联的NaYF4：Yb，Er溶液100μL，接着每个试管加入20μg/mL四环 素类抗原-BSA-金纳米溶液，分别为10、20、40、80、160μL，最后，加入适量的PBS溶液，使得游 离的四环素类抗原的最终浓度为100ng/mL放到摇床上缓慢振摇0.5h，接着进行荧光测定； 对照组试管中不添加游离的抗原溶液，加入与实验组相同的四环素类抗体偶联的NaYF4： Yb，Er溶液和四环素类抗原偶联的金纳米溶液，反应后也进行荧光测定；通过实验组和对照 组的荧光恢复的变化量来确定四环素类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液和四环素类抗原-BSA-金纳 米溶液的适浓度，形成良好的上转换纳米材料-金纳米材料体系；
7)确定四环素类药物在牛奶中的检测范围
在牛奶中掺杂一系列不同浓度的四环素类抗原，取若干个1.5mL的小试管，每个小 试管做好标记，在小试管中加入含有不同含量的四环素类抗原的牛奶溶液，牛奶溶液中的 四环素类含量分别为0.1，1，5，10，30，50，75，100，500，1000ng，然后加入30μg/mL的四环素 类抗体-NaYF4：Yb，Er溶液100μL，反应0.5h后加入适量20μg/mL四环素类抗原-BSA-金纳米 溶液；然后依次向每个小试管中加入用PBS溶液使得最终溶液的体积为200μL，然后放到摇 床上缓慢振荡40min，进行荧光测定；
8)按照步骤7)中的检测范围，检测一定范围内含有其他抗生素类牛奶样品的荧光 强度，并根据荧光强度和四环素类抗原浓度的关系，观察该方法是否具有特异性，能否检测 含有四环素类抗生素的牛奶样品。如上所述的方法中所述的四环素类抗原抗体能够对多种 四环素类药物，如四环素、氯四环素、土霉素或金霉素等有良好的交叉反应性，能够检测多种四环素类抗生素。
主要参考资料
[1] CN201610413722.9 基于提高四环素纯度的提纯方法
[2] [中国发明] CN201810460705.X 一种快速检测牛奶中四环素类药物残留的方法
