多聚磷酸盐的制备方法

背景及概述^[1-2]

多聚磷酸盐由多个磷酸分子聚合而成的一种复合磷酸盐，如三聚磷酸盐等。在食品工业中常用以防止香肠变色，帮助脂肪混合，加速食品腌制的速度，可使肉的蛋白质纤维保持更多的水分而有利于改良其结构。多聚磷酸盐(inorganic多聚磷酸盐hosphate，polyP)是由几个到几百个无机磷酸盐单体通过高能磷酸键聚合而成的线性多聚体。由于火山口和深海蒸汽喷发口存在多聚磷酸盐，多聚磷酸盐可能是磷酸盐通过高温脱水产生，广泛存在于地球初期。又因为多聚磷酸盐能够作为生物体的能源，磷酸化并活化乙醇、糖、核苷和蛋白质，因此推测它在生命的起源中具有一定作用。一个世纪之前人们在观察到异染粒时发现了多聚磷酸盐，随后发现多聚磷酸盐普遍存在于细胞中。细胞内多聚磷酸盐代谢酶以及对应基因的鉴定结果提示细胞具有自身代谢多聚磷酸盐的酶，保证细胞内多聚磷酸盐维持在相对稳定的水平。作为多价阴离子，多聚磷酸盐能够螯合Ca、Mg、Mn、Fe和Co等重要金属离子，与肌动蛋白样纤维形成复合物。另外，细胞内的多聚磷酸盐可感应各种代谢和环境信号。多聚磷酸盐广泛存在和作用表明其在生物进化和生理功能上具有不可忽视的作用。但多聚磷酸盐在物种的起源和生存上的作用需要进一步确定。

在微生物中的作用^[2]

(一)调节基因表达　多聚磷酸盐参与基因转录调控。合成多聚磷酸盐的酶多聚磷酸盐激酶(多聚磷酸盐hosphatekinase，PPK)缺失突变菌和水解多聚磷酸盐的酶外切聚磷酸酶(exo多聚磷酸盐hosphatase，PPX)过表达菌稳定期的功能缺失，对双氧水、热休克、渗透应激(osmoticstress)、紫外线和丝裂霉素等敏感，表明多聚磷酸盐涉及大量基因的表达和维持细菌对应的生理功能。例如，多聚磷酸盐调节大肠杆菌rpoS及SOS基因的表达，从而调控稳定期基因和渗透调节相关基因，以及DNA损伤修复基因的表达。基因芯片分析铜绿假单胞菌的ppk突变和野生型指数期的基因表达，发现ppk1突变体中大约有450个基因表达下调，250个基因表达上调。25个表达差异的基因中，有24个与群体效应相关(Rao等.2009)。缺铁应答系统(如pvdS、prpL、aprXDEFA、pchGFEDCBA和tonB)(Ochsner等.2002)和3型分泌系统的表达在突变菌中下调，且不完全依赖于群体效应。而且，多聚磷酸盐在体外能够与RNA聚合酶相互作用。因此，多聚磷酸盐可能是转录调控因子，尤其是毒性因子“共同调节子”。

多聚磷酸盐调节转录的机制尚不清楚。多聚磷酸盐的积累可能改变了转录产物与RNA聚合酶或RNA降解体的稳定性，增加了RNA的浓度。多聚磷酸盐也可以通过直接与转录复合物相互作用调节转录的起始。幽门螺旋杆菌σ80的氨基酸末端存在一个带正电的赖氨酸富集区可以结合多聚磷酸盐。其它人类致病菌如百日咳杆菌(bordetellapertussis)和伯纳特(氏)立克次(氏)体(coxiellaburnetii)的σ因子也存在类似的构域。多聚磷酸盐与σ的结合进而调节基因表达的方式可能是致病菌普遍应用的一种策略。多聚磷酸盐也可能作为第二信使发挥功能。大肠杆菌有很多应对环境胁迫和严紧应答的调控机制，例如当氨基酸缺乏时，严紧应答导致relA的激活，并产生大量的(p)ppGpp，从而抑制包括核糖体生物合成基因在内的众多基因的活性，激活50多个负责胁迫和饥饿基因的表达；当磷酸盐缺乏时，磷酸盐调节单元(PhoR)感受低磷酸盐水平，然后激活PhoB，活化的PhoB激活30多个基因包括碱性磷酸酶基因phoA的表达。而PhoB和(p)ppGpp的活性最终导致多聚磷酸盐的积累，表明PhoB和(p)ppGpp发挥的功能是通过高浓度的多聚磷酸盐所完成。

(二)细菌离子通道和DNA摄取　位于细菌细胞膜上的聚羟基丁酸/钙/多聚磷酸盐(多聚磷酸盐hydroxybutyrate/calcium/多聚磷酸盐，PHB/Ca2+/多聚磷酸盐)复合物赋予细菌摄取DNA的能力，同时也是阳离子选择性通道。PHB/Ca2+/多聚磷酸盐复合物首从感受态细胞中被分离出来，具有高转导性和阳离子选择性。

(三)多聚磷酸盐与细菌运动、生物膜形成、群体效应和孢子生成相关　细菌的运动包括泳动、群体运动和蹭行运动。ppk或ppx突变菌在半固体培养基上的运动受到不同程度的影响。鞭毛介导细菌的泳动和群体运动，纤毛负责蹭行运动。所以，ppk突变可能影响了鞭毛或纤毛的结构或者功能。电子显微镜显示ppk突变菌具有和野生型相同的鞭毛结构，因此ppk突变可能通过影响鞭毛或纤毛的能源供应而影响鞭毛和纤毛的运动。与运动性损伤一致的是ppk突变菌逃避氧化的能力减弱。PPK对生物膜形成、群体效应和细胞外毒力因子的产生非常重要。生物膜是细菌粘附于表面时，分泌的多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等将其自身包绕其中而形成的含有大量细菌的膜样复合体。生物膜缺陷菌株的研究表明生物膜形成经历三个阶段：首先，自由运动的细菌附着到固着点，通过鞭毛和纤毛永久性地吸附到介质表面；然后，形成的微菌落和细胞之间发生相互作用；最后，分泌的细菌表面多糖稳定生物膜结构，细胞间的信号传导调节生物膜的三维结构。PPK和鞭毛参与生物膜形成的、二阶段，而只有PPK参与第三阶段。细菌通过群体效应系统来协调相关基因的表达，调节群体的细胞密度。群体效应的lasR-lasI系统介导复杂三维结构的形成。ppk突变株的表型类似于群体效应分子合成缺陷lasI突变菌的表型，表明多聚磷酸盐可能通过调节lasI基因的表达而调节了细菌第三阶段生物膜的发育。细胞外毒力因子如弹力蛋白酶、鼠李糖等的产生由群体效应控制。ppk突变菌弹力蛋白酶的活性和鼠李糖的量分别只有野生型的7%和38%，而弹力蛋白酶基因lasB和鼠李糖基转移酶基因rhlA的表达水平只是野生型的7%和3%，ppk回复突变株能够恢复野生型。这表明PPK或多聚磷酸盐影响群体效应合成自诱导物(autoinducers，AIs)，以及AIs与其调节蛋白的相互作用。

(四)多聚磷酸盐与代谢的关系　Florian等对4765个酵母敲除突变菌进行三轮筛选，最终发现255个基因(大约占酵母基因组的4%)参与维持细胞内正常多聚磷酸盐水平。其中许多基因编码的蛋白涉及了细胞质和液泡内的功能，以及转运和转录等功能。突变菌除了表现为多聚磷酸盐水平的减少外，还表现出磷酸盐浓度、ATP、糖原水平的改变，以及酸性磷酸酶分泌的混乱。因此，细胞内能源和磷酸盐的稳定依赖于细胞内多聚磷酸盐、ATP和磷酸盐三者间的平衡，多聚磷酸盐可能作为ATP和磷酸盐水平的缓冲剂，并且影响依赖于ATP或磷酸盐的其它成分，如糖原和分泌性磷酸酶的活性。

在哺乳动物中的作用^[2]

多聚磷酸盐在人脑、肝、外周血单核细胞、红细胞、成骨细胞、成纤维细胞等中具有较高的水平。通过生物信息学方法尚未找到细菌PPX的同源蛋白或基因，但能够检测到高水平的外切聚磷酸酶活性和内切聚磷酸酶活性。多聚磷酸盐和相关代谢酶活性的存在表明多聚磷酸盐在哺乳动物中具有重要的生理功能。多聚磷酸盐能够与羟基丁酸形成离子通道，可作为ATP的替代物等特征决定了其在细胞内重要的生理功能。

(一)多聚磷酸盐调节瞬时电位melastatin8(transientreceptorpotentialmelastatin8，

TRPM8)　瞬时受体电位(transientreceptorpotential，TRP)离子通道家族是一类非选择性阳离子通道，包括多个成员，哺乳动物中存在三十多个。Melasmtatin8型TRP是该家族的成员之一，可被冷激活，也可被薄荷醇和icilin等化学物质活化，因此被认为是一种冷受体。小鼠模型证实TRPM8是一种重要的冷受体，其活性受细胞膜电位的影响，其中Ca2+内流引起去极化是一种重要激活方式。

冷处理能减轻病理因素引起的疼痛感，因此可通过调节TRPM8的生物学活性实现止痛目的。大鼠背根神经节TRPM8受体表达上调参与神经病理性疼痛的发生和维持。TRPM8除在感觉神经元处表达以感受冷刺激外，主要分布于前列腺。TRPM8并不为前列腺癌细胞PC-3细胞存活所必需，相反，高表达的TRPM8能够抑制PC-3细胞的增殖和迁移，有望成为前列腺癌治疗的一个新靶点。TRPM8发挥生理功能的作用机制与Ca2+的内流相关，适度的Ca2+离子能够激活TRPM8，过度的Ca2+则抑制其活性。多聚磷酸盐能够调节TRPM8的活性，多聚磷酸盐可与可溶性两性分子(R)-3-羟基丁酸(R-3-hydroxybutyrate，PHB)形成高选择性阳离子通道，这种作用类似于PHB/Ca2+/多聚磷酸盐复合物。

(二)多聚磷酸盐调节哺乳动物雷帕霉素靶蛋白　哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)是调节细胞生长和增殖的重要信号转导分子，同时也是一种蛋白激酶。它整合丝裂原信号、能源水平和营养状态等信息控制细胞的生长和增殖。mTOR信号通路的异常激活与肿瘤的发生、发展和转移、动脉粥样硬化、糖尿病血管并发症和心肌纤维化等密切相关。研究证实在生物体内存在两个关键的mTOR底物。一个底物是PHAS-I，也称为真核翻译起始因子4(initiationfactor4Eforeukaryotictranslation，eIF4E)结合蛋白。去磷酸化的PHAS-I能够螯合eIF4E。mTOR能够磷酸化PHASI，释放eIF4E，这促使其参与细胞生长和增殖相关蛋白的翻译(Miron等.2001)。另一个底物是40S核糖体S6蛋白激酶(p70S6激酶)，磷酸化可激活其活性。激活的p70S60激酶能够磷酸化40S核糖体S6蛋白，这增加了5'末端具有低聚嘧啶束的mRNA的翻译水平。现已证实多聚磷酸盐调节mTOR的活性和功能。链长为15～750个磷酸基单位的多聚磷酸盐是mTOR激酶的激活剂，有助于mTOR激酶的磷酸化和自磷酸化。在人类乳腺癌细胞系MCF-7中表达酵母细胞外切聚磷酸酶(scPPX1)显著抑制丝裂原、胰岛素或氨基酸激活mTOR的能力。并且PPX1的表达能抑制MCF-7在无血清培养基上的增殖。多聚磷酸盐调节mTOR的活性，原因可能是多聚磷酸盐通过mTOR来调节细胞对胁迫如营养缺乏的影响，类似于其在原核中对胁迫的应答。

(三)多聚磷酸盐调节线粒体代谢和Ca2+相关性细胞死亡　多聚磷酸盐存在于高等生物的线粒体中，并能形成与线粒体通透性转换孔(mPTP)类似的多聚磷酸盐/Ca2+/PHB复合物。mPTP又称线粒体巨型通道，是横跨线粒体内外膜之间的非选择性高导电性通道，由多种蛋白复合物组成。线粒体内膜上的mPTP的开放和形成认为是由Ca2+诱导的通透性转换(permeabilitytransition，MPT)，这导致内膜的去极化和ATP合成的中断，并涉及各种细胞的凋亡和坏死。体内多聚磷酸盐/Ca2+/PHB复合物可能构成mPTP复合物的一部分，通过在肝癌细胞、中肾细胞和未分化鼠肌原细胞表达scPPX1，发现多聚磷酸盐影响线粒体的代谢和线粒体内Ca2+的积累，多聚磷酸盐的减少显著降低Ca2+诱导的mPTP。

(四)多聚磷酸盐调节细胞的钙化　在小猎犬牙槽骨再生模型和成骨细胞发育的体外模型MC3T3-E1细胞系中的研究结果表明多聚磷酸盐诱导正常成骨样细胞的钙化。多聚磷酸盐通过不同途径诱导成骨样细胞的钙化。首先，多聚磷酸盐可能作为细胞钙化的磷酸盐来源。其次，多聚磷酸盐水解酶能够产生焦磷酸(PPi)，多聚磷酸盐、PPi和Pi之间的平衡调节细胞的钙化。第三，多聚磷酸盐能促进成纤维细胞因子(fibroblastgrowthfactors，FGFs)与其受体的结合，调节细胞的钙化。第四，多聚磷酸盐诱导降钙素(osteocalcin)、成骨相关转录因子osterix、骨唾液酸蛋白(bonesialoprotein)、组织非特异性碱性磷酸酶基因的表达。然而在生物工程中，多聚磷酸盐能够抑制软骨-骨取代物界面之间的钙化。软骨组织体外形成过程中减少多聚磷酸盐的释放能促使在组织-骨取代物界面之间钙化软骨区(zoneofcalcifiedcartilage，ZCC)的形成。ZCC阻止在软骨-软骨下骨界面之间产生高的剪切力，即使在高的机械负荷下也允许两种组织之间的整合。

(五)多聚磷酸盐调节血液凝固　人类血小板的致密颗粒中存在多聚磷酸盐70-75，受凝集素激活释放多聚磷酸盐，释放的多聚磷酸盐加速了血液的凝固。多聚磷酸盐作用于血液凝固级联的三个点加速血液的凝固：激活接触途径触发血液凝固；加快凝血因子V的活化速度，导致天然抗凝蛋白———组织因子通道抑制剂功能的赘余；加速纤维蛋白聚合成纤维蛋白原。此外，多聚磷酸盐通过增强抗纤维蛋白溶解作用剂的活性延迟血块的溶解。多聚磷酸盐及其代谢酶在细菌应答各种化学信号环境胁迫时起到非常重要的作用，包括SOS修复、严紧反应、休眠调节等。细菌高浓度的多聚磷酸盐可能败血症病人血液凝固系统的紊乱。然而，临床实验证明组织因子通道抑制剂不能够治疗败血症，这与多聚磷酸盐加快凝血因子V的活化，不需要组织因子通道抑制剂的作用一致。

制备^[3]

一种有机多聚磷酸盐的制备方法：是以磷酸烯醇式丙酮酸钾盐(PEPK)作为单体，在不超过80℃的温和反应温度下，以过硫酸盐/亚硫酸盐的氧化还原自由基引发体系进行水溶液聚合反应，制作PEPK的均聚物、PEPK与丙烯酸或甲基丙烯酸共聚单体的共聚物(投料质量比为1∶0.5～1∶20)；聚合反应结束后，采用无水乙醇等有机溶剂直接沉降洗涤提纯的方法，将聚合物剪切干燥得到产品。

主要参考资料

[1] 营养科学词典

[2] 多聚磷酸盐及其代谢酶的研究进展

[3] CN200910201213.X一种有机多聚磷酸盐的制备方法