人卵巢上皮细胞提取物的应用

背景^[1-5]

人卵巢上皮细胞提取物是从人卵巢上皮细胞提取的，人卵巢上皮细胞从正常人卵巢组织制备。人卵巢上皮细胞分离自卵巢组织；卵巢位于子宫两侧，左右各一，完全包于子宫阔韧带内，并在卵巢门外，借系膜固定于子宫阔韧带。卵巢门处有出入卵巢的血管、神经和淋巴管。卵巢是一对扁椭圆形的器官，约重4—8克，幼年时卵巢表面光滑，性成熟后，由于卵泡的生长和排卵后结成瘢痕，表面凹凸不平。卵巢表面覆盖着一层上皮，称为生殖上皮。幼年时期上皮细胞呈立方状或柱状，以后随年龄的增长而变扁平。

生殖上皮深面有一薄层致密结缔组织构成的白膜，包围卵巢的实质。卵巢的实质可分为外周的皮质与中央的髓质。皮质较宽，由许多处于不同发育阶段的卵泡和黄体及其间的结缔组织构成。髓质只占一小部分，位于中部，由富含血管的疏松结缔组织构成。婴儿出生时，两个卵巢内约有40万个原始卵泡。儿童时期，原始卵泡可以发育，但却不能成熟，因而卵巢内大量卵泡退化，成为闭锁卵泡。

从青春期到绝经期，女性有生育力的30—40年内，每28天左右卵巢内有一批卵泡发育，但一般只有一个达到成熟并排卵，其余的则在不同的发育阶段退化。绝经期的卵巢内只有少量卵泡存留，且都逐渐退化。

人卵巢上皮细胞主要功能：①上皮细胞能分泌激素，刺激卵细胞分化成熟；②细胞能分泌炎症介质，参与炎症反应。人卵巢上皮细胞采用胰蛋白酶-胶原酶联合消化法结合差速贴壁法，并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10^5cells/瓶；细胞经Cytokeratin-19/PCK免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

应用^[5][6]

构建人卵巢上皮细胞癌症模型用于卵巢上皮性癌差异蛋白的筛选及信号通路研究：

卵巢癌是女性生殖系统常见的恶性肿瘤之一,其发病率仅次于宫颈癌与子宫内膜癌位居第三。随着CA125联合经阴道超声筛查技术的应用,阳性诊断率仍仅为50%。迄今,卵巢癌仍为威胁女性健康的最主要的癌症,晚期的卵巢癌患者5年存活率仅为20%~30%。Pathway Array技术是一种具有高度敏感性和特异性的技术。该种方法用于卵巢癌差异表达蛋白的筛查尚未见相关报道。

目的：探索卵巢癌发生发展的信号转导机制,寻找用于卵巢癌早期诊断的生物学标记物及其分子治疗靶点。

方法与结果:

(1)体外实验:体外培养卵巢癌细胞和正常卵巢细胞,提取细胞总蛋白,用Pathway Array技术进行蛋白表达,用QUANTITY ONE分析软件进行差异蛋白表达谱分析,以卵巢癌细胞系SKOV3细胞为例与正常卵巢细胞系相比,6个蛋白表达水平有明显的升高:p-HER2/ErbB2、p-PDK1(Ser241)、p-Akt(Ser473)、TTF-1、ERK1/2和p-Stat3(Ser727)蛋白,4个蛋白表达水平有明显的降低:p-RB(Ser780)、p-c-Jun(Ser73)、Cdc25B和p-p53(Ser392)蛋白。

(2)卵巢癌组织中差异表达蛋白的研究:在卵巢癌组织的高水平表达蛋白共12个,即p-Stat3(Ser727)、p-PDK1(Ser241)、p-Akt(Ser473)、p-cdc2(Tyr15)、PCNA、Cdc2 p34、XIAP、E-cadherin、Cdk2、Mesothelin、p-p38(pThr180/pTyr1 82)和P53蛋白;卵巢癌组织的低表达蛋白共9个,即ERK1/2、Cdc25C、Wee-1、cdc42、Bax、N-cadherin、α-tubulin、Vimentin和PTEN蛋白。

(3)SKOV3细胞与卵巢癌组织的高水平表达蛋白有3个呈一致性高表达,即p-PDK1、p-Akt、p-Stat3;SKOV3细胞与卵巢癌组织的蛋白表达的差异性,显示在体肿瘤发生发展的复杂性,譬如,在SKOV3细胞p-p53的表达水平明显降低,而在卵巢癌组织中p-p53的表达水平则极显著地增高,是机体上调了野生型P53的表达,还是P53发生基因突变了需要进一步研究。对SKOV3细胞与卵巢癌组织中一致的高水平表达蛋白进行了免疫组织化学和Western Blot的验证,与Pathway array技术所获得的结果显示明显的一致性。

参考文献

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[6]徐红梅.卵巢上皮性癌差异蛋白的筛选及信号通路研究[D].吉林大学,2010.