软骨藻酸的作用

背景及概述^[1]

软骨藻酸(domoicacid，DA)主要是由海洋中的某些拟菱形藻属(Pseudo-nitzschia)和菱形藻属�(Nitzschia)的硅藻产生的一种藻毒素，前者为主要产毒藻种，进一步研究发现能够产生软骨藻酸的拟菱形藻主要有尖刺拟菱形藻多列型(P.pungensf.multiserie)、伪优美拟菱形藻(P.pseudodelicatissima)、成列拟菱形藻(P.seriata)和澳洲拟菱形藻(P.australis)等。

软骨藻酸化学结构与谷氨酸和红藻氨酸相似，具有兴奋性毒性，误食过量的软骨藻酸中毒后会导致记忆缺失。最早报道的人类软骨藻酸中毒事件发生在1987年加拿大爱德华王子岛，因食用受软骨藻酸污染的贻贝导致100多人中毒，临床表现为胃肠道症状和神经系统紊乱，并且有4人死亡。目前研究结果显示，有相当一部分滤食性海洋生物能够在其体内累积软骨藻酸，其中包括双壳贝类、鱼类(如鳀鱼和鲭鱼)和甲壳类(如螃蟹)等，并且对软骨藻酸有较强的耐受力，再经食物链传递会对所在地区的生态环境造成影响，对水生动物及人类健康造成极大危害。

最新研究发现，在葡萄牙沿海9月下旬到11月的非拟菱形藻生长期，在章鱼的食物(贝类)中未检测到软骨藻酸，而章鱼的消化腺中却检测到了软骨藻酸，这很可能是由于章鱼长期富集软骨藻酸所致，可见软骨藻酸能通过贝类等的富集进入海洋生物的食物链中。此外，食物链中一些高级的海洋生物(如鲸鱼、海狮和海鸟等)均有软骨藻酸中毒的报道。

目前对软骨藻酸致兴奋性神经毒作用机制的研究并不多见，根据相关文献报道兴奋性神经毒性是促进神经元退行性病变的重要机制之一，因此对软骨藻酸致神经毒作用机制研究可能为癫痫，老年痴呆等神经退行性疾病的治疗提供新的思路。

化学特性^[2]

软骨藻酸(分子式C15H21NO6，分子量311.3)是由水中藻类产生的一种生物毒素，结构与红藻氨酸和谷氨酸相似，是红藻氨酸受体的兴奋剂。目前发现能产生该毒素的硅藻类有Pseudonitzschiaaustralis，P.pungensf.multiseries，P.pseudodelicatissima等。检测水中P.australis的含量及软骨藻酸的浓度，当该藻类在水中的含量仅为4.0×103/L时，即可检出软骨藻酸。

生物富集作用^[2]

水中的蛤蜊、蚌类及鱼均可富集水中藻类产生的软骨藻酸，并对软骨藻酸有较强的耐受力。软骨藻酸经食物链富集后，会对所在地区的生态环境造成影响，并引起动物发病和死亡。1996年加利福尼亚半岛发生褐色鹈鹕大量死亡事件。调查研究表明，海鸟的死亡与食用受硅藻污染的鲭鱼有关，而这些硅藻可产生软骨藻酸。为防止含该毒素的产品进入市场，对当地罐头工厂进行产品安全检查，并采取有效检测措施，防止了软骨藻酸的扩散和同类事件的发生。

1991年秋，美国加利福尼亚州蒙特利湾和奥尔良沿海海鸟大量死亡，也是一起软骨藻酸中毒事件，并分离出了能产生软骨藻酸的藻类。研究软骨藻酸在水生植物及动物体内的分布，对制定卫生标准及防止中毒事故发生具有重要意义。于1991～1993年对不同季节的蛤蜊及蛤蜊的不同部位进行软骨藻酸含量测定，发现其可食用部分软骨藻酸含量12月份最高，平均可达106mg/kg，此后逐渐下降。但在浓度达到高峰后16个月，蛤蜊体内的软骨藻酸仍不能完全消失。此外，蛤蜊的各个部位均能检出软骨藻酸，其中足部浓度最高，可达223mg/kg；虹吸管部位的浓度最低。

结果表明如果软骨藻酸在邓杰内斯蟹的肝胰腺中的污染浓度不超过30mg/kg，在蛤中不超过20mg/kg时，在相关人群及消费蟹类和蛤类较少的人群中，未见到与软骨藻酸毒性有关的健康影响。软骨藻酸经食物链富集后，也可引起海洋哺乳动物中毒死亡。1998年5月和6月，沿中加利福尼亚海岸有400多头海狮死亡；许多海狮出现神经功能紊乱症状。同时在该地区海湾发现了假菱形藻属(硅藻)赤潮。

此种赤潮中的藻类可产生软骨藻酸。在食浮游生物的鱼(包括北部凤尾鱼和沙丁鱼)和海狮的组织和尿液中均检出软骨藻酸。凤尾鱼内脏软骨藻酸浓度高达233±5μg/g。海狮以这些鱼类为食。海狮粪便中软骨藻酸浓度为125～136μg/g。对这些同时发生事件的观察结果表明，软骨藻酸经食物链富集，最终导致海洋哺乳动物死亡。在软骨藻酸产生高峰期采集的蓝蚌几乎不含或仅含微量的软骨藻酸。

因此仅对蚌类的毒性进行监测无法有效地对进入食物链中足以影响海洋生物甚至人类健康的软骨藻酸的危害作出判定。至今普遍认为水中的软骨藻酸由藻类产生，经食物链和其它方式被水生动物(尤其是贝类)不断浓集，毒素浓度可达相当高的水平，而人或动物食用被污染的水产品即可引起食物中毒。软骨藻酸污染不仅危害人类健康，同时给水产养殖业造成重大损失。

人类健康的影响^[2]

软骨藻酸具有神经兴奋作用和神经毒性作用，可引起记忆损害，还能导致中毒的人和动物死亡。1987～1988年加拿大发生一起以胃肠道症状及罕见的神经系统症状为主要表现的食物中毒暴发流行，250多人发病，中毒症状包括呕吐(76%)、腹部痉挛(52%)、腹泻(42%)、头痛(43%)，部分病人出现癫痫发作、昏迷及短时间记忆丧失(25%)、血压不稳，3例病人死亡。调查结果表明，这起严重中毒暴发流行是由于食用含有软骨藻酸毒素的蛤类引起的，为首次报道的由软骨藻酸引起的食物中毒。

对一位软骨藻酸食物中毒的男性患者的研究发现，中毒症状包括恶心、呕吐、意识模糊、昏迷，3周后症状改善，但仍有经常性的癫痫发作并伴有记忆缺失。脑电图初期表现为周期性癫痫样放电，中毒一年后发展为复杂的不完全癫痫发作，脑电图表现为双侧颞叶分别出现癫痫样放电，核磁共振造影显示海马萎缩，尸检发现双侧海马硬化。在另外4名中毒患者的海马和杏仁核中亦发现了类似的病理变化，并出现相同的神经损害症状。

毒性作用及机制^[2]

1.软骨藻酸中毒时除表现出胃肠道症状外，还出现严重的中枢神经系统损害症状，包括记忆丧失、昏迷等。因此，自1987年加拿大首次在蛤类中检出软骨藻酸以来，对该毒素的毒性作用机制、生态分布、检测技术等的研究受到广泛重视，近年来有关报道越来越多。软骨藻酸可引起人和动物较严重的中枢神经损害。动物实验表明，软骨藻酸对与内脏功能有关的脑干区域具有兴奋作用，而对与记忆有关的脑区域具有明显的神经毒性作用。大鼠腹腔注射软骨藻酸的LD50为3600μg/kg。大鼠脑室内染毒(0.03～3nmol)时，低剂量组出现颤抖、运动过强、面部阵挛，高剂量组出现癫痫征候群。

2.软骨藻酸对脊髓的损害也受到重视。给出生后7d的大鼠皮下注射软骨藻酸，剂量分别为0.10、0.17、0.25、0.33、0.42和0.50mg/kg，各个剂量组均出现软骨藻酸引起的抓挠、尾部轻弹及游泳样运动等症状。高剂量组进一步出现后肢麻痹、前肢颤动，2小时内出现死亡。在0.33mg/kg剂量组出现死亡和麻痹的百分率分别为47%和65%。记录该剂量组的动物皮层脑电图和同步干扰电活动，未见脑损伤。应用微分析技术检测软骨藻酸对纹状体多巴胺活性的影响，结果表明脑内给予不同剂量的软骨藻酸可使大鼠纹状体细胞外多巴胺水平增加及细胞外多巴胺代谢产物降低。

神经毒理学研究表明，钙离子作为细胞内信使，参与几乎一切外来信号调控细胞功能的信息转导过程，也是参与细胞内代谢活动的重要元素，因此细胞内钙稳态的维持对于生命活动是至关重要的，在神经细胞的损伤中具有特殊作用。这些研究结果表明在培养的新生海马锥体细胞中至少有两种对软骨藻酸敏感的非N-甲基-D-天冬氨酸受体亚型，软骨藻酸引起的钙进入机制是经电压依赖型钙通道实现的。

制备^[3]

一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法，包括以下步骤：

1)菌株活化：将斜面菌种接种到摇瓶种子液培养基中，在30-32℃下培养12-15h，得到活化菌株种子液；

2)种子液准备：向种子培养液中通入蒸汽加热，121-123℃灭菌25-35min，冷却至30-31℃，采用火种接种法将活化菌株种子液接种到种子培养液中，通气搅拌，通气量为40-50L/min，搅拌速率为160-180r/min，30-33℃下恒温培养15-18h，得到种子液；

3)发酵：向发酵液中通入蒸汽加热，121-123℃灭菌25-35min，冷却至30-31℃，将步骤2)得到的种子液接种到发酵液中，通气搅拌，通气量为40-60L/min，搅拌转速140-160r/min，30-33℃下恒温培养48-52h，得到遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液；

4)提取：将遗忘性贝毒软骨藻酸发酵液进行板框过滤得到菌体，加入甲醇溶液，静置10-20min，过滤，得到一次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10-20min，过滤，得到二次提取液和过滤菌体；将过滤菌体加入甲醇溶液中，静置10-20min，过滤，得到三次提取液，将一次提取液、二次提取液和三次提取液合并，旋蒸浓缩，得到遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物；

5)纯化：将遗忘性贝毒软骨藻酸粗提物进行洗脱，收集遗忘性贝毒软骨藻酸组分，旋转蒸发，除去溶剂，得到白色粉末，即为遗忘性贝毒软骨藻酸。

主要参考资料

[1] 软骨藻酸神经毒性作用机制研究进展

[2] 水生态环境中神经毒性生物毒素——软骨藻酸

[3] CN201811168447.4一种利用海洋硅藻共栖细菌发酵制备遗忘性贝毒软骨藻酸的方法