大鼠食管平滑肌细胞的应用

背景^[1-5]

大鼠食管平滑肌细胞分离自食管组织；食管可分为颈段、胸段和腹段，脊椎动物食管的颈段位于气管背后和脊柱前端，胸段位于左、右肺之间的纵膈内，胸段通过膈孔与腹腔内腹相连，腹段很短与胃相连。哺乳动物的食管结构上由内向外分四层：黏膜层、黏膜下层、肌层和外膜。其中，肌层上1/3段为骨骼肌，下1/3为平滑肌，中段为骨骼肌和平滑肌混合组成。其中，肌纤维的排列方式分为内环形和外纵形两层。食管的蠕动是由食管平滑肌收缩严格控制，食管还有括约肌，位于环状软骨水平的，称为食管上括约肌；位于食管下端，一部分在膈上，穿过膈孔，另一部分在膈下的高压带，称为食管下括约肌。

食管平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。 

大鼠食管平滑肌细胞细胞特性

1)组织来源于实验动物的正常食管组织。

2)细胞鉴定：平滑肌肌动蛋白（α-SMA）免疫荧光染色为阳性。

3)经鉴定细胞纯度高于90%。

4)不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5)细胞生长方式：长梭形细胞，不规则细胞，贴壁培养。

应用^[6]

用于5-羟色胺对大鼠食管平滑肌动力功能的影响及其机制研究。

胃食管反流(GER)是指胃内容物,包括从十二指肠反流入胃的胆盐和胰液等反流入食管甚至口咽部的一种生理现象,但如果反流频率和持续时间增加到一定程度,达到病理状态和/或者给机体带来不适时则称为胃食管反流病(GERD).GERD属于动力异常性疾病,发病机制尚未阐明,主要因素有食管下括约肌(LES)功能失调、食管黏膜清除能力下降、食管黏膜屏障功能损伤、食管内脏高敏性。正常的LES功能和食管蠕动功能有赖于食管平滑肌的协调性收缩和舒张,后者的生理基础是食管平滑肌对不同神经递质的正常反应性。因此,食管平滑肌对不同神经递质的反应性在反流性食管炎(RE)发病机制研究中受到重视。

5-羟色胺(5-HT)是调节胃肠道运动、分泌及感觉功能的重要神经递质。90%存在于消化道黏膜,8%-10%存在于血小板,1%-2%存在于中枢神经系统。目前,发现的人类5-HT受体存在14种类型,胃肠道存在主要有以下几种：5-HT1A、5-HT1B、5-HT1P、5-HT2A、5-HT2B、5-HT3、5-HT7、5-HT4Ro其中5-HT4R已被证实在人类和动物食管组织中均有表达,与食管的动力功能的关系近年来受到密切关注。

研究5-HT对ESMC胞内游离Ca2+的影响：选用8周龄雄性SD大鼠20只进行ESMC原代培养,利用特异性Ca2+荧光指示剂Fluo-3AM负载细胞,应用激光共聚焦显微镜观察5-HT对细胞内游离Ca2+浓度的影响。并进一步在去除细胞外液Ca2+、分别加入5-HT4R特异性拮抗剂GR13808孵育、PKA抑制剂H-89孵育、L型钙通道阻滞剂盐酸维拉帕米孵育后观察5-HT对细胞内游离Ca2+浓度的影响。结果：5-HT在浓度为10-9-10-5mol/L时对于预收缩的食管黏膜肌条具有舒张作用,加入5-HT4R拮抗剂GR113808后5-HT对食管黏膜肌条的舒张作用程度降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。

西酞普兰在浓度10-4、10-3mol/L时对于食管黏膜肌条具有收缩作用。5-HT在浓度为10-6、10-5mol/L时对于食管下括约肌条具有收缩作用,加入5-HT4R拮抗剂GR113808后对食管下括约肌条的收缩作用程度较未加入时降低,差异具有统计学意义(P<0.05)。西酞普兰在浓度10-3mol/L对于食管下括约肌条具有收缩作用。5-HT(10-5mol/L)可以升高ESMC胞内游离Ca2+浓度。当去除细胞外液中Ca2+、及用GR113808、H-89、盐酸维拉帕米孵育后,可以有效的抑制5-HT对于胞内游离Ca2+的影响。结论：1.5-HT通过作用于5-HT4R对离体食管黏膜肌条具有舒张作用,对于离体食管下括约肌条具有收缩作用。2.5-HT再摄取抑制剂西酞普兰对离体食管黏膜肌条和食管下括约肌条均具有收缩作用。3.5-HT通过作用于食管平滑肌细胞的5-HT4R,可升高胞内游离Ca2+浓度。

参考文献

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[6]张婷.5-羟色胺对大鼠食管平滑肌动力功能的影响及其机制研究[D].浙江大学,2012.