DNAzol试剂的应用

背景^[1-3]

DNAzol Reagent是一种即用型有机试剂，专门用于在约30分钟内从全血中分离基因组DNA。DNAzol Reagent是一种完全的、可直接使用的基因组DNA提取试剂，简单高效，结果可靠，可快速提取基因组DNA，适用于多种大量或少量样品。DNAzol可在一个步骤中裂解细胞并水解RNA，经过乙醇沉淀后即可快速得到基因组DNA。整个过程只需10-30分钟，DNA回收率可达70-100％，得到的DNA不需再纯化，可直接用于Southern杂交、斑点杂交、分子克隆、PCR反应和其他分子生物学应用。

特点：

1.专门用于从全血中提取基因组DNA

2.优化用于快速分离基因

DNAzol Reagent专门用于从全血中分离基因组DNA。DNAzol Reagent基于使用新型胍-去污剂裂解液，该溶液可水解RNA并允许从裂解液中选择性沉淀DNA。可以使用1mlDNAzol Reagent从0.5 ml全血中分离基因组DNA，得到10-20μgDNA。除了分离基因组DNA外，DNAzol Reagent还可用于分离全血中的凋亡片段和血清中的病毒DNA。

DNAzol Reagent在其隔离协议中结合了可靠性，效率和简单性。在该过程中，将血液样品与DNAzol试剂混合，并用异丙醇从所得裂解物中沉淀DNA。然后依次用DNAzol试剂洗涤DNA沉淀，接着用乙醇洗涤，然后溶解。整个过程可在约30分钟内完成。

操作步骤：

1.裂解，匀浆：

a.组织：25-50mg组织加1ml DNAzol，使用匀浆仪处理5-10次。少量（5-10mg）柔软组织，如脾或脑组织，可切成或者捣成小块使用微量取样器吹打混匀，室温放置5-10分钟。

b.细胞：单层培养的细胞应直接裂解，倒出培养基，加入DNAzol用取样器吹打几次混匀。每10cm2细胞培养板加0.75-1.0ml DNAzol。

c.细胞沉淀或悬浮液：每1-3×107细胞（体积小于0.1ml）加1ml DNAzol，反复吹打混匀。

以上均要使用大口径枪头吹打，以免过度剪切断基因组。

2.离心：4-25℃，10000g离心10分钟。将得到的上清转入新管。此步骤去除组织碎片、部分水解的RNA和多糖。如果所提样品为含较多细胞和细胞外物质的样品，如肝、肌肉和大部分植物组织等，或要提取不含RNA的DNA时，可加此步骤。其他样品可省略此步。

3.沉淀：每使用1ml DNAzol加0.5ml 100%乙醇，颠倒离心管5-8次，混匀样品至出现DNA沉淀，室温放置1-3分钟。可以看见DNA絮状沉淀，让沉淀自然沉降到管底，尽可能吸弃上清。用枪头搅绕DNA贴附在离心管上端壁上，仔细吸弃剩下的在管底和管壁的上清。如果因为剪切太厉害导致形成小片段或者量少的DNA(少于15ug)，无法缠绕到枪头上，可在4-25℃，4000g离心1-2分钟沉淀DNA，弃上清。

4.漂洗：用0.8-1ml 75％乙醇漂洗DNA两次。漂洗时，将DNA悬浮在乙醇中，颠倒离心管3-6次，然后静置0.5-1分钟使DNA沉降到管底，尽可能吸弃上清。如果需要，可在4-25℃，1000g离心1-2分钟沉淀DNA。从组织中提取DNA时，如需去除其他内含物，次漂洗可用70％DNAzol和30％乙醇的溶液代替75％乙醇。

5.溶解：用枪吸去残余的乙醇，晾干几秒钟后立刻用8mM NaOH溶解DNA（DNA暴露于空气几秒钟都会大大加大溶解难度，因此乙醇晾后立刻溶解）。可将沉淀吸到大口径枪头中缓慢通过数次来帮助溶解。TE缓冲液和水溶解效果不完全，因此建议用碱溶液，可更快速且彻底的溶解。

通常，从107细胞或10-20mg动物组织中提取的DNA可用0.2-0.3ml 8mM NaOH溶解，使DNA浓度约为0.2-0.3ug/ul。如果从植物、肝脏、肌肉等富含糖原的材料提取DNA，最后可能会有一些残留物（多糖）无法溶解，可以用12,000Xg离心10分钟去除。8mM NaOH容易被空气氧化，应该用不超过6个月的2-4mol的NaOH储存液，每月配制一次。

6.结果检测：

以8mM NaOH溶液溶解的DNA（用DNAzol提取的DNA在Tris缓冲液中溶解效果不好）在紫外分光光度计检测A260/A280，A260为1相当于50ug双链DNA/ml。得到的A260/A280应为1.6-1.9，片段大小为20-100kb。得到的DNA片段大小取决于提取过程中机械外力对DNA的破坏程度.

应用^[4][5]

DNAzol试剂可用于全血基因组DNA的快速提取：

采用不完全溶血剂STMT处理全血样品，异硫氰酸胍裂解白细胞核，硅胶特异性吸附释放出来的DNA，漂洗液洗去硅胶上非DNA成分，最后用TE把DNA从硅胶上洗脱下来。对所建立的方法的实验条件包括异硫氰酸胍(GuSCN)浓度、结合液pH值、结合温度等进行优化，从而得到高质量的DNA溶液，建立异硫氰酸胍-硅胶法。并对所建立的方法通过以下几方面进行评价，包括DNA的产量、DNA的纯度、DNA的完整性、RNA的污染、重复性，以及将纯化产物应用于PCR反应和限制性内切酶消化，并与传统的SDS-蛋白酶K/苯酚-氯仿(简称酚-仿)法进行比较。

结果：1、异硫氰酸胍(GuSCN)浓度、结合液pH值和结合温度等影响异硫氰酸胍-硅胶法的提取效率。其条件是GuSCN浓度为4M、结合液pH值为6.5、结合温度为37℃。2、异硫氰酸胍-硅胶法提取DNA平均含量(3.7μg/100μl全血)高于酚-仿法(2.99μg/100μl全血)(p＜0.05)，纯度(OD260/OD280 1.78)与酚-仿法(OD260/OD280 1.76)无显著差异(p＞0.05)；RNA污染试验表明，该方法提取的DNA基本上无RNA污染；琼脂糖凝胶电泳结果显示，该方法提取的DNA为大分子物质，在紫外吸收有典型的DNA紫外吸收峰。3、该方法重复性好，提取DNA的产量批内变异系数为6.02％，纯度批内变异系数为6.74％。4、提取DNA适合于限制性酶切反应，PCR反应等。

结论：1、建立简单、快速提取全血基因组DNA的异硫氰酸胍-硅胶法，整个提取过程费时小于40min。2、提取的DNA质量高、纯度好，适用于大多数分子生物学实验，如PCR、限制性酶切反应等。3、费用低，无需贵重试剂和特殊仪器，易于临床实验室大规模使用。

参考文献

[1]Maternal serum cell-free fetal DNA levels are increased in cases of trisomy 13 but not trisomy 18[J].Tuangsit Wataganara,Erik S.LeShane,Antonio Farina,Geralyn M.Messerlian,Thomas Lee,Jacob A.Canick,Diana W.Bianchi.Human Genetics.2003(2)

[2]Detection of male and female fetal DNA in maternal plasma by multiplex fluorescent polymerase chain reaction amplification of short tandem repeats[J].B.Pertl,A.Sekizawa,O.Samura,I.Orescovic,P.T.Rahaim,D.W.Bianchi.Human Genetics.2000(1)

[3]DNA isolation by a rapid method from human blood samples:Effects of MgCl2,EDTA,storage time,and temperature on DNA yield and quality[J].Debomoy K.Lahiri,Bill Schnabel.Biochemical Genetics.1993(7)

[4]介绍一种简便快速的可供临床实验室使用的DNA提取、纯化方法[J].秦秋平.生命的化学(中国生物化学会通讯).1991(03)

[5]罗心静.全血基因组DNA的快速提取及其应用[D].中南大学,2003.