PureLink HiPure质粒过滤大提试剂盒的应用

背景^[1-5]

PureLink HiPure质粒过滤大提试剂盒设计用于从25至500 ml菌液中分离最高纯度的质粒DNA。PureLink™HiPure过滤法质粒提取试剂盒(PureLink™HiPure Plasmid Filter Kit)包括HiPure过滤柱，将细菌裂解液澄清过滤与质粒DNA阴离子交换树脂纯化整合到一个单元。所得质粒DNA的质量相当于进行了两次氯化铯梯度离心，后者是最严格的DNA纯化方法。不到两小时即可纯化出适于转染和其它应用的高质量DNA，无需通过额外步骤去除污染物，如RNA、蛋白或内毒素。另外，方案中去除了酚、氯仿、溴化乙锭和氯化铯，因而程度减少了有害物质的接触和处理。

PureLink HiPure质粒过滤大提试剂盒特点：

•简单的方案-无需离心就可澄清细菌裂解液；

•快速获得结果-不到两小时就可完成质粒DNA的纯化，节省时间；

•高产量-中量提取产量高达200µg，大量提取产量高达850µg；

•可靠的性能-使用这些试剂盒纯化的高质量质粒DNA适用于多种应用。

工作原理：

PureLink HiPure质粒过滤大提试剂盒的HiPure过滤柱，无需离心即可快速澄清细菌裂解液。裂解液过滤筒整合到了DNA结合柱，在同一个步骤中，既能澄清裂解液，又可使质粒DNA直接结合到阴离子交换树脂上。单次柱洗涤即可去除杂质，例如：RNA、蛋白质、代谢物和其它低分子量分子，超纯质粒DNA用高盐缓冲液洗脱。然后进行异丙醇沉淀步骤，脱盐和浓缩DNA，再通过离心的方法回收DNA。整个方案可在约两小时内完成。

应用^[6][7]

PureLink HiPure质粒过滤大提试剂盒用于乙型肝炎病毒全基因质粒在SV40T永生化小鼠肝细胞中的表达：

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)是嗜肝DNA病毒属的一员。HBV可以引起肝脏的急、慢性感染,HBV的慢性感染是引起严重肝脏疾病的主要病因。据世界卫生组织报道,全球20多亿人曾感染乙肝病毒,其中3.5亿以上为慢性乙型肝炎病毒感染者。

乙型肝炎的治疗取决于几个因素,如疾病的阶段,“e”抗原的存在或缺失、耐药性、特别是在肝脏慢性疾病的终末期后期无有效药物治疗。因此,在治疗时机的选择及治疗过程中对以上因素的评价是非常重要的。将SV40早期转录区基因导入细胞内是最常用的细胞永生化的方法,几乎适用于各种人类细胞类型。通过对SV40T基因介导的永生化细胞系的深入研究,多数研究结果显示SV40T基因的导入除提高转化细胞的生长速率外,能保留其原始细胞的许多分化表型,而非原始基因的表达很少见,在细胞水平上可反映其原始细胞的生物学特性,可作为体外研究的模型。

1.3拷贝HBVDNA质粒含HBV完整复制体,基因组小于2.0拷贝,且复制和表达效率高于1.2和1.1拷贝,包含了HBV5’末端EnhⅠ、EnhⅡ,复制起始区(DR1、DR2)、前基因组转录起始位点x和前C区启动子,x开放读码框等,所以应用的最多。经SV40T抗原转染的小鼠肝细胞系可以被pHBV1.3质粒二次转染,转染后HBV可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成病毒复制中间体。并且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg;pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。

总结：本研究结果证实,pRSV-T质粒可以使小鼠肝细胞永生化,建立SV40T永生化小鼠肝细胞系。SV40T永生化小鼠肝细胞系具有原代小鼠肝细胞形态和生长特性,且在体外可以传代培养。且可以被pHBVl.3质粒二次转染,转染后乙型肝炎病毒可以在SV40T抗原转染的永生化小鼠肝细胞内进行病毒基因的复制,形成ssDNA、dsDNA和rcDNA病毒复制中间体,且进一步进行病毒基因的表达,合成HBV特异性蛋白HBsAg、HBeAg和HBcAg；pHBV1.3质粒转染后永生化小鼠肝细胞能合成子代病毒颗粒并分泌出细胞。

参考文献

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