PureLink HiPure质粒大提试剂盒的应用

背景^[1-5]

PureLink HiPure质粒大提试剂盒使用新型专有、阴离子交换树脂纯化最高水平的转染级质粒DNA。增强型树脂结合大容量、快速流速、高分离度和高效内毒素去除功能。质粒分离通常在约90分钟内完成，纯度等同于使用氯化铯（CsCl）梯度法分离获得的纯度。

PureLink HiPure Expi质粒纯化试剂盒提供超大量和宏量抽提，可以最快的流程获得最高转染级的质粒DNA。PureLink HiPure Expi Plasmid试剂盒包括真空过滤柱，可在不离心的情况下进行细菌过滤，从而实现极快处理。

该试剂盒通常从500 mL细菌培养物中分离出4 mg高品质超纯质粒DNA，固有内毒素水平低。以简单、快速、低成本的从大肠杆菌培养物中分离质粒DNA。该试剂盒结合了硅胶结合技术和离心柱形式的便利性，可在45分钟内从25-200 ml LB培养基中回收出多达1.2mg的质粒DNA。请注意，实际得率和的培养物体积取决于质粒和培养基。

PureLink HiPure质粒大提试剂盒通过离心分离法收集过夜培养的重组大肠杆菌培养物，并通过改性SDS碱裂解法进行处理，之后再在高盐环境下使DNA吸附到硅胶膜上。随后通过离心洗涤步骤去除污染物。最后，在水或Tris-EDTA缓冲液中洗脱结合所得的DNA。

该试剂盒的优势包括：

1.高产量–单次纯化1 L细菌培养物分离出超过5 mg的高品质质粒DNA

2纯度–固有内毒素水平低（通常为0.1-1.0 Eu/μg），A260/A280>1.8，尤其适用于哺乳动物细胞转染

3.简单、快速–结合真空辅助方案，典型的质粒分离仅需90分钟即可完成

应用^[6][7]

PureLink HiPure质粒大提试剂盒可用于抑制素对小鼠卵泡发育和精子发生的分子和细胞调控机制研究：

抑制素是由性腺所分泌的糖蛋白质激素,与激活素一起调控垂体促卵泡素(FSH)合成和分泌,进而调控卵泡发育和精子发生,影响动物的生殖能力。本研究通过分析抑制素在波精子发生过程中的mRNA和蛋白的时空表达谱,研究了抑制素在精子发生中的作用,并以RNAi-Ready pSIREN-RetroQZsGreen plasmid为载体,以抑制素α亚基基因(Inha)作为研究抑制素功能的候选基因,构建了三对Inha RNAi重组质粒,通过转染小鼠颗粒细胞和支持细胞,研究了抑制素对两种细胞的发育调控作用机制及与卵泡发育和精子发生相关基因的表达作用,并用卵巢直接注射法研究了重组质粒对卵巢组织作用研究。

为抑制素研究卵泡发育和精子发生机制奠定了基础,并对人类生殖调控的研究有重要的借鉴作用,为以后开发促进精子发生、卵泡发育、提高超数排卵、人工孪生,转基因动物的新技术有重要的指导意义。抑制素RNAi对体外培养小鼠睾丸支持细胞生长发育和精子发生相关基因表达的作用构建了pshRNA-1、pshRNA-2和pshRNA-3共3个Inha RNAi重组质粒,转染至支持细胞,应用Real-Time PCR,Western blot分析了转染48h后RNAi的效果,筛选出抑制效果干扰组,应用Real-Time PCR,Western blot和流式细胞术研究抑制素对支持细胞细胞周期和精子发生相关基因表达的影响,发现：

(1)RNAi可显著降低小鼠支持细胞目的基因的表达量,pshRNA-1、pshRNA-2、pshRNA-3均可显著降低Inha的mRNA和蛋白表达水平,其中以pshRNA-2重组质粒干扰效果最为显著,对Inha mRNA的抑制率为58%；

(2)Inha RNAi后,小鼠支持细胞Inhba,Inhbb,Dhh和Tip1mRNA表达量上调,Pdgfa和Kitl mRNA表达量下调；

(3)Inha RNAi后,小鼠支持细胞INHBA,INHBB和P21蛋白的表达量上调；CyclinD1 CyclinE蛋白的表达量下调；

(4)Inha RNAi后,S期的小鼠支持细胞比例显著减少,G1期的小鼠支持细胞比例显著增加；结果表明,抑制素通过调控支持细胞的细胞周期(G1至S期的过渡期),影响其生长发育,并且抑制素与支持细胞表达的与精子生成有关的基因Dhh,Tip1,Pdgfa和Kitl的表达有影响。

抑制素RNAi对小鼠卵巢颗粒细胞的生长发育调控作用及其机制研究用pshRNA-1、pshRNA-2和pshRNA-3共3个Inha RNAi重组质粒,转染至颗粒细胞,应用Real-Time PCR,Western blot分析了转染48h后RNAi的效果,筛选出抑制效果干扰组,应用Real-Time PCR,Western blot和流式细胞术研究抑制素对颗粒细胞凋亡、细胞周期和卵泡发育相关基因表达的影响。

参考文献

[1]Regulation of apoptosis in nucleus pulposus cells by optimized exogenous Bcl‐2 overexpression[J].Hideki Sudo,Akio Minami.J.Orthop.Res..2010(12)

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[3]Stable knockdown of TPPP3 by RNA interference in Lewis lung carcinoma cell inhibits tumor growth and metastasis[J].Wenbai Zhou,Jiada Li,Xuanchun Wang,Renming Hu.Molecular and Cellular Biochemistry.2010(1)

[4]Investigating the association between inhibin alpha gene promoter polymorphisms and premature ovarian failure[J].Kathryn J.Woad,Shona M.Pearson,Sarah E.Harris,Ksenija Gersak,Andrew N.Shelling.Fertility and Sterility.2009(1)

[5]Loss of inhibin alpha uncouples oocyte-granulosa cell dynamics and disrupts postnatal folliculogenesis[J].Michelle Myers,Brooke S.Middlebrook,Martin M.Matzuk,Stephanie A.Pangas.Developmental Biology.2009(2)

[6]Activins and inhibins:Novel regulators of thymocyte development[J].Paula Licona-Limón,German Alemán-Muench,Jesus Chimal-Monroy,Marina Macías-Silva,Eduardo A.García-Zepeda,Martin M.Matzuk,Teresa I.Fortoul,Gloria Soldevila.Biochemical and Biophysical Research Communications.2009(2)

[7]蔡开来.抑制素对小鼠卵泡发育和精子发生的分子和细胞调控机制研究[D].华中农业大学,2011.