GeneJET质粒大提试剂盒的应用

背景^[1-5]

GeneJET质粒大提试剂盒采用硅胶膜技术，方便旋转柱形式。每个制剂可回收高达750μg的高拷贝质粒DNA，可用于多种分子生物学程序，如限制性内切酶消化，PCR，克隆，转化，自动测序，体外转录和稳健细胞系的转染。

质粒大提是质粒大量提取的简称，有些实验室称之为大抽。顾名思义就是一次性大量培养细菌，大规模地从细菌中将扩增的质粒提取出来。一般质粒大量制备的用途是用于细胞的转染，一来是因为可以大量获得DNA，另外就是因为现在实验室质粒大提都是使用质粒大提纯化柱，如QIAGEN等等。提取出来的质粒纯度高，杂质少，无内毒素，是直接转染级别的。

质粒大提程序：

1)200mL含有50mg/mL氨苄或30mg/mL卡纳的培养基中振摇过夜（12-14h）；

2)50mL离心管，4℃，4000rpm,10min收集2份细胞；

3)每管加5mLSTE悬浮细胞后，4℃，4000rpm,10min收集细胞，置-20℃贮存10min；

4)室温解冻后，每管加4mL冰预冷的溶液Ⅰ，重悬细胞；

5)室温下每管加8mL溶液Ⅱ后充分混匀，室温静置5-10min；

6)每管加6mL冰预冷的溶液Ⅲ，充分混匀，冰浴静置10min；

7)4℃，11000rpm,30min收集裂解上清液（用纱布过滤）；

8)每管加0.6倍体积异丙醇，室温静置10min；

9)4℃，8000rpm,15min收集核酸沉淀，每管加5mL70%乙醇清洗；

10)4℃，8000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴；

11)每管加2mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min；

12)每管加2mL7.5mol/L乙酸铵溶液，冰浴静置10min；

13)4℃，10000rpm,10min收集上清，每管加4mL异丙醇，混匀；

14)4℃，10000rpm,10min收集沉淀，4-5mL70%乙醇清洗沉淀；

15)4℃，10000rpm,5min收集沉淀，晾10-15min，直至管壁无液滴；

16)每管加1mLTE溶解核酸，4℃或冰浴静置30min；

17)两份溶液和到一管，加8μL10mg/mLRNase A，混匀转入EP管（每管转入500μL），37℃水浴静置30-60min；

18)每管加250μL酚，250μL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相（aμL）；

19)每管加aμL仿醇（24:1）抽提，4℃，12000rpm,10min，收集上清水相（bμL）；

20)每管加2bμL-20℃乙醇和0.1bμL乙酸钠溶液，-20℃静置过夜；

21)4℃，12000rpm,10min收集沉淀，每管加200μL70%乙醇清洗；

22)4℃，12000rpm,5min收集沉淀，晾5-10min，直至管壁无液滴；

23)每管加10-15μLTE溶解沉淀，合并到一个EP管中，保存于-20℃冰箱中。

应用^[6][7]

GeneJET质粒大提试剂盒可用于SARS-CoV刺突蛋白的融合蛋白在哺乳动物细胞中的高量表达纯化及功能研究：

SARS-CoV刺突蛋白的融合蛋白在哺乳动物细胞中的高量表达纯化及功能研究论文导致严重急性呼吸综合征(SARS)世界性爆发流行的病原体是一种新型的冠状病毒SARS冠状病毒(SARS-CoV)。SARS是一种以呼吸系统症状为主要表现的全身性疾病，可引起全身多器官多组织损伤，导致患者死亡的主要病因为急性呼吸窘迫综合征(ARDS)。

其宿主范围广，传播速度快，且可通过飞沫甚至空气传播，危害极大。现有研究证实，SARS-CoV的刺突蛋白(Spike protein，S蛋白)是病毒表面的最重要的膜蛋白，能够与受体结合并促进病毒入胞，并且是诱发机体免疫系统产生中和抗体的主要抗原蛋白。但由于S蛋白存在大量的翻译后修饰位点，主要是糖基化位点，致使通过原核细胞表达或酵母表达的蛋白将不能正确地折叠，影响其生物活性。只有在哺乳动物细胞系统中进行表达，S蛋白才能进行正确地修饰，折叠和加工处理，从而保持蛋白的活性。

但在哺乳动物细胞系统中表达SARS-CoV编码的S蛋白又存在表达量低的特点，难以在实际中应用。通过实现S蛋白及其不同片段在哺乳动物细胞系统中高量表达及纯化，使S蛋白及其片段的大规模生产成为可能，从而为SARS-CoV基因工程重组疫苗的规模化生产和应用提供可能。建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的以维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型建立绿色荧光蛋白(GFP)标记的以维甲酸受体为靶点的高通量药物筛选细胞模型，可用于筛选治疗急性早幼粒细胞白血病(APL)、银屑病、痤疮以及肿瘤的新型药物，具有很大的应用前景和市场价值。

参考文献

[1]Identification of a critical neutralization determinant of severe acute respiratory syndrome(SARS)-associated coronavirus:importance for designing SARS vaccines[J].Yuxian He,Qingyu Zhu,Shuwen Liu,Yusen Zhou,Baoan Yang,Jiaming Li,Shibo Jiang.Virology.2005(1)

[2]Identification of two antigenic epitopes on SARS-CoV spike protein[J].Ronghong Hua,Yanjun Zhou,Yunfeng Wang,Yuzhuo Hua,Guangzhi Tong.Biochemical and Biophysical Research Communications.2004(3)

[3]Unique and Conserved Features of Genome and Proteome of SARS-coronavirus,an Early Split-off From the Coronavirus Group 2 Lineage[J].Eric J.Snijder,Peter J.Bredenbeek,Jessika C.Dobbe,Volker Thiel,John Ziebuhr,Leo L.M.Poon,Yi Guan,Mikhail Rozanov,Willy J.M.Spaan,Alexander E.Gorbalenya.Journal of Molecular Biology.2003(5)

[4]The SARS-CoV S glycoprotein:expression and functional characterization[J].Xiaodong Xiao,Samitabh Chakraborti,Anthony S Dimitrov,Kosi Gramatikoff,Dimiter S Dimitrov.Biochemical and Biophysical Research Communications.2003(4)

[5]Retinoid,Retinoic Acid Receptorβand Breast Cancer[J].Qifeng Yang,Takeo Sakurai,Kennichi Kakudo.Breast Cancer Research and Treatment.2002(2)

[6]Creation of a Stable Human Reporter Cell Line Suitable for FACS-Based,Transdominant Genetic Selection[J].Burt Richards,Jon Karpilow,Christine Dunn,Ludmilla Zharkikh,Andrew Maxfield,Alexander Kamb,David H.-F.Teng.Somatic Cell and Molecular Genetics.1999(4)

[7]郭峰.SARS-CoV刺突蛋白的融合蛋白在哺乳动物细胞中的高量表达纯化及功能研究[D].中国协和医科大学,2006.