Long Taq DNA聚合酶的应用

背景^[1-6]

Long Taq DNA聚合酶是由pfu DNA聚合酶和Taq DNA聚合酶按照一定的比例混合而成。两种酶协同作用实现了扩增效率、合成速度和延伸性能的完美统一，可以合成超长的DNA*(代"片")段。当扩增具有复杂的二级结构(GC rich等)的模板或具有重复序列的模板时，使用GC buffer进行PCR扩增将非常有效。另外，此酶具有比Taq DNA聚合酶约5倍的PCR可信度。该酶的大多数PCR产物3’端带碱基A，可以通过TA克隆法进行克隆。

Long-Taq DNA聚合酶的基本特征，它在机体的胚胎发育、组织修复、内环境的稳定等方面起着十分重要的作用。在细胞凋亡过程中，细胞内膜的磷酯酰丝氨酸外翻到细胞外膜，而Annexin V（膜联蛋白V）对其有天然的高亲和能力，故可以用荧光素555标记的Annexin V来检测细胞凋亡。

特点:

1.为长片段扩增特别优化,使用常规PCR Buffer即可扩增8-10kb,使用超长Buffer扩增长度可达20-40kb。

2．反应速度快,聚合速度高达10-15sec/kb,可为科研人员节约多达70%的实验时间。

3．扩增效率高,同等条件下产量远高于普通Taq酶,在扩增片段时优势尤其明显。

4．比活性高,分子量小于普通Taq酶。在相同酶量下有更高的酶活性。

5．低背景,显著减少非特异性条带和引物二聚体。

6．高稳定性,耐热性能,Long-Taq酶的T1/2=2.5-3 hour(100℃),12 hour(95℃),普通Taq酶的T1/2=1.6 hour(95℃),特别适合对高GC含量的模板的扩增。

应用^[7][8]

Long Taq DNA聚合酶可用于短链和长链复杂模板DNA的扩增，特别适合于高GC含量DNA的扩增。

滚环扩增（Rolling circle amplification，RCA），是一种在等温条件下就能特异性扩增目标片段的扩增技术，主要利用环状模板和具有链置换能力的DNA聚合酶环绕模板进行周期性的复制。常见技术应用为都以锁式探针RCA（padlock-RCA）引发扩增。虽然灵敏度高，但也有单链探针不稳定、探针与模板容易错配、扩增产物并非目标序列而是互补的探针自身的缺点。

针对于此，本文使用了一种全新的目标成环RCA（Target-circularization RCA，TC-RCA）：利用限制性内切酶酶切样品，产生具有9nt粘性末端的序列；其次，设计与目标序列粘性末端完全互补配对的双链接头，在连接酶的作用下同目标序列连接成环；利用具有链置换活性的DNA聚合酶，在两条引物的作用下引发超分支-RCA（Hyper-branched RCA）；最后，扩增产物再经过限制性内切酶酶切，得到扩增后的目的片段。

在此基础上，利用高特异性的DNA连接酶、生物素修饰接头、链霉亲和素磁珠以及磁性分离等手段，构建了磁珠辅助的TC-RCA技术。该项技术能够在等温条件下从大量背景核酸中检测出目标序列，从根本上解决了检测特异性和灵敏度之间的矛盾关系，特别适用于检测食品中有害微生物的存在。TC-RCA可以在大量背景核酸中检测出目标序列，敏感度达到6×106个拷贝分子，但结果伴有非特异性扩增。

使用连接忠实度较高的Taq DNA连接酶进行连接，没有能够达到提高特异性的目的。主要是由于Taq DNA连接酶在非正常的缓冲液条件下，区别错配能力降低所致。说明TC-RCA已经初步具备成为一种新型检测方法的能力，同时为后续的实验提供了解决问题的思路和依据。

参考文献

[1]Magnetic nano-beads based separation combined with propidium monoazide treatment and multiplex PCR assay for simultaneous detection of viable Salmonella Typhimurium,Escherichia coli O157:H7 and Listeria monocytogenes in food products[J].Youjun Yang,Feng Xu,Hengyi Xu,Zoraida P.Aguilar,Ruijiang Niu,Yong Yuan,Jichang Sun,Xingyong You,Weihua Lai,Yonghua Xiong,Cuixiang Wan,Hua Wei.Food Microbiology.2013(2)

[2]Double-probe signal enhancing strategy for toxin aptasensing based on rolling circle amplification[J].Ping Tong,Wei-Wei Zhao,Lan Zhang,Jing-Juan Xu,Hong-Yuan Chen.Biosensors and Bioelectronics.2011(1)

[3]NanoDrop fluorometry adopted for microassays of proteasomal enzyme activities[J].Analytical Biochemistry.2011(2)

[4]An electrochemiluminescent assay for high sensitive detection of mercury(II)based on isothermal rolling circular amplification[J].Xiaoming Zhou,Qiang Su,Da Xing.Analytica Chimica Acta.2011

[5]Development of monoclonal antibody based sandwich ELISA for the rapid detection of pathogenic Vibrio parahaemolyticus in seafood[J].Ballamoole Krishna Kumar,Pendru Raghunath,Devananda Devegowda,Vijay Kumar Deekshit,Moleyur Nagarajappa Venugopal,Iddya Karunasagar,Indrani Karunasagar.International Journal of Food Microbiology.2011(1)

[6]An On‐Nanoparticle Rolling‐Circle Amplification Platform for Ultrasensitive Protein Detection in Biological Fluids[J].JuanYan,ShipingSong,BingLi,QingzhiZhang,QingHuang,HuaZhang,ChunhaiFan.Small.2010(22)

[7]Ultrasensitive Detection of microRNAs by Exponential Isothermal Amplification[J].HongxiaJia,ZhengpingLi,ChenghuiLiu,YongqiangCheng.Angewandte Chemie International Edition.2010(32)

[8]王星宇.基于靶序列环化的新型滚环扩增方法的建立及其应用[D].中国海洋大学,2014.