Real Taq DNA聚合酶的应用

背景^[1-7]

Real Taq DNA聚合酶是从克隆有Thermu aquaticus DNA Polymerase基因的大肠杆菌经诱导表达后分离纯化的，其分子量为94 KD。具有5’-3’DNA聚合酶活性和5’-3’外切核酸酶活性，无3’-5’外切酶活性。在PCR反应中，Real Taq DNA Polymerase延伸速度为1-2 kb/分钟，产物3’端带A，可直接用TA载体克隆。

TaqDNA聚合酶是一种耐高温的依赖于DNA模板的DNA聚合酶，来源于极度嗜热的嗜热水生菌Thermus aquaticus YT一1，故称作Taq DNA聚合酶，一般应用于PCR反应。TaqDNA聚合酶是一种Mg2+依赖酶，反应体系中必须有Mg2+存在，然而保持适当的Mg2+浓度十分重要，因为Mg2+浓度过高或过低均会影响引物与模板的结合、模板与PCR产物的解链温度、引物二聚体的形成以及酶的活性与精确性。

该酶的优点是：①热稳定性高，92.5℃、95℃、97.5℃时的半衰期分别为130min、40min和5～6min；②最适反应温度为75℃，引物在50℃～60℃退火，72℃延伸，可防止引物与模板间的错配及DNA二级结构的形成，从而提高了扩增特异性，且有利于扩增较长的片段，70℃时延伸速率在60核苷酸/秒以上；③可延迟平台区，平台区到达之前即可完成25次循环，扩增倍数达4 X 10⁶，然而该酶存在一个致命的缺点，即缺乏3’一5’外切酶活性，无法校正错误核苷酸的掺入．错误掺入率达2×10^-4个核苷酸/循环，对于一个30次循环的扩增反应来说，这将导致0.25%的总错误率。

应用^[8][9]

Real Taq DNA聚合酶可用于DNA片段的PCR扩增、DNA标记、引物延伸、序列测定、平末端加A等，产物可以直接用于T/A载体克隆。

Taq DNA聚合酶在PCR中的应用,普通Taq DNA聚合酶虽然得到广泛使用,但是仍然存在不足。各个实验室针对Taq DNA聚合酶的不足进行了不同形式的改造,以降低或消除酶的5’→3’核酸外切酶活性,提高酶的续进性、忠实性、特异性和耐热性等。通过定点突变和缺失突变的方法在基因水平对Taq DNA聚合酶进行改造,以消除酶的5’→3’核酸外切酶活性和降低Taq DNA聚合酶对ddNTP的抵抗,并对改造后的酶蛋白进行表达纯化。

将改造的酶进行了各方面的应用。稀土元素对生物体DNA确有损伤作用,但有关稀土对DNA致突机理的研究较少,尤其是在DNA分子水平方面的研究不多。本实验的研究目的也是探讨稀土离子引起DNA损伤的机理,主要从稀土对TaqDNA聚合酶的作用着手。通过在PCR反应体系中加入不同浓度的稀土离子(La3+、Gd3+和Er3+)后,检测PCR产物DNA浓度、DNA序列中碱基变化,然后借助紫外光谱法和圆二色谱法来分析TaqDNA聚合酶立体构象的变化,从而确定稀土对Taq DNA聚合酶的作用是否会影响到DNA复制错误。

实验结果:在PCR反应过程中分别加入三种稀土离子,当La3+和Gd3+浓度在1.0×10-3mol/L和1.0×10-8mol/L之间时,对PCR反应的影响呈现出“低促高抑”的Hormesis现象,当其浓度大于1.0×10-2mol/L时,完全抑制DNA复制,而Er3+总体呈较强的抑制作用,当浓度低时,也没有激活作用出现;PCR反应产物序列有多处碱基发生错配;La3+、Er3+和Gd3+会引起Taq DNA聚合酶的紫外可见吸收谱发生变化,且稀土离子浓度越大,Taq DNA聚合酶液在222nm处的吸收峰值越低;通过圆二色谱测定,稀土离子可影响TaqDNA聚合酶的二级结构,低浓度的稀土离子能引起TaqDNA酶α-螺旋含量的增加,而高浓度稀土离子引起酶α-螺旋含量降低。

实验结果说明了稀土离子可影响TaqDNA聚合酶的立体构象,除了能改变酶的DNA复制活性,也可引起DNA复制时碱基错配。这一实验结果也说明了稀土是一种诱变剂,引起基因突变的机制之一可能是改变TaqDNA聚合酶的立体构象,干扰了酶与底物dNTP结合位点,从而引起复制错配。

参考文献

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