大鼠气管和支气管上皮细胞的制备方法

背景及概述^[1]

上皮细胞覆盖于身体表面并衬贴于体内空腔器官腔面的细胞。其排列有明显极性，一面朝向身体表面或腔面，称游离面：一面向着深部的结缔组织，称基底面。上皮细胞具有强大的角生和更新能力。上皮组织具有保护、吸收、分泌和排泄等作用。当上皮细胞受损时，则影响机体的防御功能。

大鼠气管-支气管上皮细胞是研究氡及其子体致肺癌机理及放射毒理学的良好模型，上皮细胞的分离和培养是进行后续研究的关键。获得大鼠气管-支气管上皮细胞的常用方法是链酶蛋白酶消化法，但该法在细胞收获量、纯度和成活率等方面尚存在不足。

制备^[1]

1. 气管-支气管无血清完全F12培养基的制备：气管-支气管无血清完全F12培养基是由Ham'sF12培养基补以5μgml牛垂体提取物，3mgml牛血清白蛋白，5μgml上皮生长因子，50μmoll磷酸乙醇胺，50μgml胰岛素，50μgml转铁蛋白，0.3μmoll氢化可的松，2mmoll的丙酮酸钠。

2. 气管-支气管上皮细胞的分离

7～8周的雄性Wistar大鼠5只，3.6%水合氯醛麻醉后，无菌条件下暴露气管和肺，环状软骨下方插管，生理盐水灌洗3次，下端在左右肺门处结扎，去除肺组织，然后灌入1%链酶蛋白酶，结扎上端，4℃过夜，置于90mm培养皿中，用Ham'sF12培养基冲洗气管-支气管，再剪开气管-支气管用细胞刷充分刷洗，4号针头收集培养皿中的刷洗液，离心洗涤收集细胞。取0.1ml细胞悬液，台盼蓝染色后计数，计算存活率。

3. 气管-支气管上皮细胞的鉴定及纯度

分离得到的气管-支气管上皮细胞，以1×105个接种于预先放置两张盖玻片和无血清完全F12培养基的60mm培养皿内，24h后，弃培养液，收集两张爬片，4%多聚甲醛固定30min，再经梯度甲醇复水，PBS洗涤三次，一张爬片加Pancytokeratin，另一张做对照加双蒸水，37℃孵育1.5h，PBS洗涤三次，再加GoatantimouseIgGFITC避光作用30min，PBS洗涤三次，然后用DAPI染色30min，PBS洗涤后在激光共聚焦显微镜下观察，计算纯度。

细胞在抗角蛋白抗体作用后，经FITC和DAPI染色，在激光共聚焦显微镜下可见，所有的细胞核呈蓝色荧光，而胞浆呈绿色荧光或无荧光，其中胞核呈蓝色荧光胞浆呈绿色荧光的细胞为上皮细胞，见图1。计数细胞后，计算上皮细胞的纯度。由结果可见，经24h贴壁后，细胞的纯度约为90.66%。

4. 气管-支气管上皮细胞的培养

分离得到的气管-支气管上皮细胞以1×105个60mm平皿接种于无血清完全F12培养基中，37℃，5%CO2温箱培养，24h后取一个培养皿，弃培养液，收集贴壁细胞计数，计算贴壁率，其余培养皿3d换液，5d传代。

主要参考资料

[1] 儿科学辞典

[2] 大鼠气管-支气管上皮细胞的分离、鉴定和培养