大鼠结肠平滑肌细胞的制备方法

背景及概述^[1]

大鼠结肠平滑肌细胞分离自结肠组织；结肠在右髂窝内续于盲肠，在第3骶椎平面连接直肠。结肠分升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠4部分，大部分固定于腹后壁，结肠的排列酷似英文字母“M”，将小肠包围在内。结肠横切面由内到外依次为：黏膜（上皮层、固有层、黏膜肌层），黏膜下层（疏松结缔组织），肌层（内环形、外纵行两层平滑肌），外膜（纤维膜或浆膜）。大鼠结肠平滑肌细胞主要分布于黏膜肌层和肌层的内环形、外纵行平滑肌；结肠运动少而缓慢，对刺激的反应也较迟缓。结肠平滑肌在食物消化与吸收、肠道运动和物质分泌、诱发全身炎症反应以及细胞内信号转导途径等研究中起着重要的作用。大鼠结肠平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展，细胞形态大小不一，呈梭形、不规则形、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏；细胞密度低时，常交织成网状；密度高时，则排列为旋涡状或栅栏状。传代后细胞生长较快，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点。结肠平滑肌运动活性受到神经递质、胃肠激素和药物等因素的调节。随着现代胃肠动力学研究的进展，对胃肠运动的研究已从器官、组织水平发展到细胞、分子水平，要求在胃肠道单个平滑肌细胞标本上来完成各种电生理、药理和分子生物学等实验。体外培养细胞，由于影响因素单一，是研究细胞功能以及相应的细胞信号转导机制的基础。

制备^[1]

1)单个大鼠结肠平滑肌细胞的分离

参照Bitar法加以改进，Wistar大鼠，180~220g，雌雄不限，实验前禁食24h，自由饮水。颈椎脱臼处死，剖开腹腔，快速自肛门上2cm取结肠约10cm，并放置在4℃无钙台氏液中，冲洗结肠内残余粪便。将冲洗干净的肠段移入含无钙台氏液的塑料培养板中，体视显微镜下采用机械法小心的刮除黏膜层、黏膜下层及浆膜层，将较纯的平滑肌组织层剪成1~2mm3的碎块，加入到消化液中，37℃恒温水浴震荡20min，200g/min离心5min，弃消化液。再加入10ml消化液，37℃恒温水浴震荡20min，加2倍无钙台氏液中止消化，用玻璃吸管柔和吹打3min，使细胞自由脱落，尼龙网过筛(孔径500μm)，离心，弃上清，加适量KB液悬浮细胞，4℃冰箱储存待用，电生理实验一般在8h内使用。

2）细胞形态观察　

单个大鼠结肠平滑肌细胞在KB液中保存1h后，离心，采用梯度复钙法，使细胞外Ca2+终浓度恢复至1mmol/L后，取一滴细胞悬液置于倒置显微镜下观察细胞形态。光镜下观察，细胞呈梭形，横纹清晰，遮光性较强，长度各异，有的舒张，有的收缩，细胞成活率90%左右(图1a)，细胞外Ca2+浓度恢复至1mmol/L后，细胞仍能保持长梭形，细胞边缘清晰，有光泽(图1b)。经台盼蓝染色，80%以上的长梭状平滑肌细胞不染色并保持正常形态，提示细胞成活率达80%。

3）细胞活性检测　

0.4%台盼蓝溶液与细胞悬液1∶1混合，室温放置3~5min，取20μl细胞悬液置于血细胞计数板上，高倍镜下观察细胞存活状况。死细胞染成淡蓝色，而活细胞不染色并保持正常形态。

4）细胞钙电流记录　

细胞池中预先冲入钙电流细胞外液，取已复钙的细胞悬液加入细胞池中，静止10min使细胞贴壁。将充灌电极内液的玻璃微电极与细胞膜接触，给予轻微负压开始封接，当封接电阻大于1GΩ后即形成高阻封接，破膜，形成全细胞模式，采用Axopatch200B放大器(AXON公司)记录细胞膜钙电流。电极尖端电阻以2~6MΩ为宜。

5）钙电流数据采用Clampfit10软件进行分析，并通过Sigmaplot软件进行作图及曲线拟合。

A：-80mV钳制电压钳制细胞，给予10ms的快速刺激，使快钠通道失活，再给予-40mV的钳制电压，从-40mV开始，以10mV的阶跃刺激连续去极化至+50mV，持续500ms，刺激频率0.5Hz，记录细胞钙稳态激活电流(图2a)。

B：ICa-L电流-电压(I-V)曲线：大鼠结肠平滑肌细胞激活电压为-10mV，反转电位为33mV(图2b)

C：采用双脉冲刺激，保持电压-80mV，先给予条件脉冲从-90mV，每隔10mV连续去极化至0mV，持续300ms，然后至-40mV，间期1ms，再跟一固定的去极化至0mV，持续140ms的测试脉冲。记录细胞钙稳态失活曲线(图2c)。

D：采用双脉冲刺激，保持电压-40mV，先给予去极化至0mV，持续260ms的条件脉冲，再给一同样的刺激脉冲，两脉冲的间隔时间从0~1s逐渐增加，每次75ms。记录细胞钙稳态失活曲线(图2d)。

主要参考资料

[1] 新编实用医学词典

[2] 大鼠结肠平滑肌细胞分离及电生理功能鉴定