BY4741感受态细胞的应用

背景^[1-6]

BY4741感受态细胞来源于酿酒酵母原始菌株——S288C，是实验室的常用菌株，为配子MATa型，广泛应用于钠，钾离子平衡；细胞抗盐；各种金属离子的吸收；重金属毒性；各种糖类，碳源对真核生物细胞生长的影响；过氧化物，超氧化物的吸收与运输的研究中。BY4741酿酒酵母为组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、尿嘧啶缺陷型菌株，可直接通过PEG/LiAc将pYES2质粒转化进入BY4741细胞内。

质粒pYES2的筛选标志为URA，可用SD-URA板板进行筛选。唯地生物生产的BY4741感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒检测转化效率>103 cfu/μg DNA。

BY4741酿酒酵母为组氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸 、尿嘧啶缺陷型菌株，可直接通过PEG/LiAc将pYES2质粒转化进入BY4741细胞内。质粒pYES2的筛选标志为URA，可用SD-URA板板进行筛选。

BY4741感受态细胞操作方法：

1.取100μl冰上融化的BY4741感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒1-3μg，Carrier DNA(96℃水浴3 min，快速冰浴

3 min，重复一次)10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min(15 min时翻转6-8次混匀)。

2.将感受态移到42℃水浴15 min(7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3.5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清。

4.ddH2O 50μl重悬，涂板，29℃培养48-96 h。

注意事项：

1.感受态细胞在冰上融化。

2.若使用pYES2质粒表达蛋白，需在培养基中加入2%的半乳糖（筛选培养基中不用加半乳糖；当需要目的蛋白表达时，需加入半乳糖代替葡萄糖作为碳源），以诱导目的基因的表达。

3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

4.同时转化2-3种质粒时可增加质粒的用量。

5.酵母为真核生物，不易长期保存，随感受态在-80℃保存时间的延长，转化效率会不断下降，建议保存时间不超过90天。

6.BY4741酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

7.酵母在缺陷培养基中生长速度比YPDA培养基慢，培养基中缺陷成分越多，生长越慢，以转化涂板为例：涂YPDA平板29℃，48 h培养可见直径1 mm克隆；涂SD单缺平板29℃，48-60 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD双缺平板29℃，60-80 h培养可见直径1 mm克隆，涂SD三缺或四缺平板平板29℃，80-90h培养可见直径1 mm克隆。

应用^[7-8]

BY4741感受态细胞可用于跨膜区突变对ABC转运蛋白Pdr5p功能的影响及其机制研究：

真菌感染在临床上能导致高致死率,在艾滋病病人和接受器官移植或者进行化疗的免疫缺陷群体中更为明显。抗真菌药物的长期使用可能导致药物耐受和治疗失败。以致病微生物为对象研究药物抗性产生的机制对于解决日益严重的耐药问题非常重要。致病酿酒酵母菌株YJM789具有许多与致病性相关的表型。

在本研究中,使用通过全基因组铺瓦芯片进行基因分型的四分体分离子库对导致酿酒酵母BY4741(实验室菌株)与YJM789菌株氟康唑抗性差异的基因进行遗传定位,结果显示YJM789中PDR5基因序列的巨大变异是导致其对氟康唑高度敏感的关键因素。PDR5基因编码一个外排泵,它通过外排大量结构差异很大的毒性化合物赋予细胞多药物抗性。使用GFP分别标记了BY4741与YJM789中的PDR5,荧光显微镜观察表明YJM789中Pdr5p-GFP融合蛋白定位于细胞膜,且过表达YJM789PDR5无法回补BY4741pdr5缺失株的抗药表型。

这些结果说明在YJM789中由Pdr5p所介导的唑类药物抗性下降不是由于Pdr5p错误定位或表达下调而是由Pdr5p功能受损所引起。在药物琼脂平板及液体培养液中比较了YJM789与BY4741对唑类及多烯类抗真菌药物的抗性,结果表明虽然YJM789中PDR5突变导致其对氟康唑外排能力严重受损,但同样的突变却赋予细胞在多烯抗生素下生长的优势。

为研究序列变异对YJM789Pdr5p功能的影响,通过片段替换的方法将划分的BY4741PDR5片段替换为YJM789PDR5的相应片段,构建了一序列PDR5嵌合表达载体。通过使用氟康唑与放线菌酮抗性实验评估各Pdr5p嵌合体的外排功能,同时研究其表达、亚细胞定位、ATPase活性以及罗丹明6G外排效率等特性,结果显示位于预测的连接第十与第十一跨膜螺旋胞内环内1352位点由丙氨酸到甲硫氨酸的突变可导致Pdr5p药物外排能力严重下降,且其影响程度与突变残基的大小相关。

参考文献

[1]Multidrug efflux pumps: Substrate selection in ATP‐binding cassette multidrug efflux pumps – first come, first served?[J] . RobertErnst,PetraKueppers,JanStindt,KarlKuchler,LutzSchmitt.  FEBS Journal . 2010 (3)

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[3]Antifungal drug resistance of oral fungi[J] . Masakazu Niimi,Norman A. Firth,Richard D. Cannon.  Odontology . 2010 (1)

[4]Plant ABC proteins – a unified nomenclature and updated inventory[J] . Paul J. Verrier,David Bird,Bo Burla,Elie Dassa,Cyrille Forestier,Markus Geisler,Markus Klein,üner Kolukisaoglu,Youngsook Lee,Enrico Martinoia,Angus Murphy,Philip A. Rea,Lacey Samuels,Burkhard Schulz,Edgar P. Spalding,Kazufumi Yazaki,Frederica L. Theodoulou.  Trends in Plant Science . 2008 (4)

[5]The yeast Pdr5p multidrug transporter: How does it recognize so many substrates?[J] . John Golin,Suresh V. Ambudkar,Leopold May.  Biochemical and Biophysical Research Communications . 2007 (1)

[6]Amphotericin B Formulation Confusion and Mortality in an HIV-Seropositive Patient[J] . Jeffrey Stroup,Johnny Stephens,Damon Baker,Madhuri Lad.  Hospital Pharmacy . 2007 (6)

[7]The Biology of the Cryptococcus neoformans Species Complex[J] . Xiaorong Lin,Joseph Heitman.  Annual Review of Microbiology . 2006

[8]郭晓贤. 跨膜区突变对ABC转运蛋白Pdr5p功能的影响及其机制研究[D].浙江大学,2012.