大鼠滑膜细胞的制备方法

发布日期:2020/10/18 17:56:53

背景及概述^[1]

关节囊分为两层，外层为纤维层，由致密结缔组织构成；内层为滑膜，由薄层疏松结缔组织构成，有产生和吸收滑液的作用。滑膜内富有血管、神经，其游离面被覆1～4层滑膜细胞。滑膜细胞呈扁平或多边形，细胞核为梭形、圆形或卵圆形。滑膜细胞呈疏松的上皮样排列，无基膜。有些滑膜细胞的表面具有分支的突起，这些突起沿表面水平伸展，相邻细胞的突起彼此呈指状交叉，有的表面具有少数丝状伪足。在滑膜细胞之间的间隙内有少量结缔组织基质，细胞间隙的基质与滑液接触，进行物质交换。根据电镜研究，滑膜细胞可分为A型和B型，以前者为多。A型细胞表面有丝状伪足，胞质内有大型高尔基复合体、很多溶酶体、吞饮小泡和微丝等，但粗面内质网很少。

B型细胞内有丰富的粗面内质网和游离核糖体，而其它细胞器少。A型细胞类似巨噬细胞，B型细胞类似成纤维细胞，但这二型细胞可能是同一种细胞不同的功能状态。滑膜细胞的功能是产生滑液的粘蛋白，并有吞噬作用，以A型细胞的吞噬作用更活跃。常用的原代大鼠滑膜细胞培养方法主要是组织块培养法、酶消化法、机械分散法等。实验通过不同方法分离、培养Wistar大鼠滑膜细胞，使用倒置相差显微镜观察不同方法培养的细胞的形态，并创新的采用了人工贴壁培养方法，并将其与自然贴壁方法作比较，选出分离培养方法。

制备^[1]

滑膜细胞的培养：将分离的滑膜组织用含青霉素200kU/L、链霉素200mg/L的D-Hank's液漂洗3次以减少污染机会；去掉脂肪组织，将16个滑膜组织样本平均分为A、B两份。将A份不加处理分为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8八个样品，将B份用手术剪剪碎后分为B1、B2、B3、B4、B5、B6、B7、B8八个样品。分别采取4种不同方法进行处理。

1）不加消化酶消化法：分别将A1、A2、B1、B2离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，加入100μL100%的FBS混匀，用移液枪吸出注入培养瓶中，放入CO2培养箱烘干15min，再将A1、B1加入3mL体积分数20%的FBS吹打均匀，A2、B2用少量体积分数20%的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20%的FBS。

2）加Ⅱ型胶原酶消化法：将A3、A4、B3、B4离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，吸取胶原酶Ⅱ至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，移入培养瓶，放入CO2培养箱消化，观察组织成絮状后，加入1mL体积分数20%FBS终止消化，用移液枪吸出，移入离心管离心(2500r/min，离心6min)，弃上清液，放入培养瓶中，A3、B3加入3mL体积分数20%FBS，吹打均匀；A4、B4用少量体积分数20%的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20%的FBS。

3）加胰蛋白酶消化法：将A5、A6、B5、B6离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，吸取胰蛋白酶至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，移入培养瓶，放入CO2培养箱消化，观察组织成絮状后，加入体积分数20%FBS终止消化，用移液枪吸出，移入离心管离心(2500r/min，离心6min)。弃上清液，放入培养瓶中，A5、B5加入3mL体积分数20%FBS，吹打均匀；A6、B6用少量体积分数20%的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20%的FBS。

4）先加Ⅱ型胶原酶消化法再加胰蛋白酶消化：将A7、A8、B7、B8离心洗涤2次(2500r/min，离心6min)，吸弃上清液，吸取胶原酶Ⅱ至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，移入培养瓶，放入CO2培养箱消化，观察组织成絮状后，取出培养瓶，仔细吹打使组织块分散，将未黏附细胞移入离心管离心(2500r/min，离心6min)，弃上清液，再加D-Hank's液洗涤，离心，吸弃洗涤液，重复离心3次，吸取胰蛋白酶至离心管中，轻轻吹打使组织块重新悬浮，移入培养瓶，放入CO2培养箱消化，消化结束取出培养瓶，加入体积分数20%FBS终止消化，用移液枪吸出，移入离心管离心(2500r/min，离心6min)。弃上清液，放入培养瓶中，A7、B7加入3mL体积分数20%FBS，吹打均匀；A8、B8用少量体积分数20%的FBS人工贴壁，再加入3mL体积分数20%的FBS。

5）结果：培养9d后，观察各培养瓶中细胞的成活个数和生长状况，组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养的细胞得数为2.03×106，是所有培养方法中细胞的数最多的。细胞活力为95%，与组织剪碎加胶原酶Ⅱ消化后人工贴壁培养同为各种培养方法中细胞活力最强的，综合考虑方法为组织剪碎不加消化酶人工贴壁培养。