大鼠关节软骨细胞的制备方法

发布日期:2020/10/18 17:56:53

背景及概述^[1]

软骨细胞是软骨组织中的主要细胞成分。位于软骨陷窝中。软骨细胞的核小，呈圆形或椭圆形，有1至数个核仁，胞质略嗜碱性。细胞形状依软骨组织而异：在透明软骨，靠近软骨膜的细胞呈椭圆形，其长轴与软骨表面平行，深部的细胞逐渐变为圆形或卵圆形，常常两个或多个聚集成群，称为同源细胞群；在弹性软骨，细胞的形态基本上与透明软骨的相似；在纤维软骨，细胞略呈卵圆形，夹在胶原纤维束之间，单个存在、成对存在或排列成单行。大鼠关节软骨细胞分离自卵巢组织；卵巢是雌性动物的生殖器官，卵巢的功能是产生卵以及类固醇激素。卵巢的位置与睾丸相同，仅左侧发育（右侧已退化），呈葡萄状，均为处于不同发育时期的卵泡，卵泡呈黄色，卵巢表面密布血管。卵巢的大小与年龄和产卵期有关。

大多数脊椎动物有两个卵巢，但是部分鱼类的两个卵巢融合为单个结构，而所有鸟类只有左侧卵巢有机能。卵巢是位于子宫两侧的一对卵圆形的生殖器官，它的外表有一层上皮组织，其下方有薄层的结缔组织。卵巢的内部结构可分为皮质和髓质。皮质位于卵巢的周围部分，主要由卵泡和结缔组织构成；髓质位于中央，由疏松结缔组织构成，其中有许多血管、淋巴管和神经。卵巢颗粒细胞是卵巢的主要功能细胞，其增殖与分化直接影响着卵泡的生长启动、发育、排卵、黄体形成以及甾体激素分泌等卵巢功能活动。卵巢颗粒细胞是卵泡内的细胞群，也是主要的功能细胞，卵泡发育的显著标志就是颗粒细胞迅速生长及增殖，而成年动物的卵泡闭锁主要是由颗粒细胞凋亡引起，尤其在卵泡发育后期，此外，颗粒细胞还与卵泡膜细胞共同完成卵巢激素的合成，维持着有利于卵母细胞生长和成熟的微环境。细胞形状呈圆形或椭圆形。

制备^[1]

1）大鼠关节软骨细胞的取材、培养及细胞一般生物活性测定

取4～5周龄，体重185～200g的SD大鼠，断颈处死，置于5%CO2混和气体环境中，37℃恒温箱内单层培养，隔3d首次换液，8～10d达85%融合后进行传代。以台盼蓝染色法计算细胞活性。活性细胞获得率(个/g)=细胞总数/软骨消化量。细胞存活率(%)=活性细胞总数/(活性细胞总数+死细胞总数)×100%。细胞贴壁率(%)=(接种细胞总数-漂浮细胞数)×100%。软骨细胞群体倍增时间(doubblingtimeDT)的测定：DT=(t-t0)log2/(logn-logn0)。接种时培养时间t0，细胞计数为n0；收集时培养时间为t，细胞计数为n。

2）倒置相差显微镜下形态学观察

取每代贴壁软骨细胞于倒置相差显微镜观察细胞生长情况。倒置相差显微镜观察：原代软骨细胞9～12h部分贴壁，大部分在24h时完成贴壁，部分细胞开始伸展，细胞体积较小，呈多角形，均匀散在生长，48h内基本上铺展成三角或多角形；7～10d达到90%融合形成单层细胞，细胞仍呈多角形或短梭形，细胞排列紧密，折光性强。传代细胞贴壁时间为2～4h，第1～2代细胞生长旺盛，3～4d细胞即可融合，细胞呈多角形小部分细胞形态狭长。第3代细胞形态逐渐变狭长，折光性减弱。第5代以后，均呈长梭型老化。8、9代后细胞梭状铺平，镜下长而大，折光差，部分细胞脱落，形态不规则。见图1。

3）软骨细胞透射电镜观察胰酶消化各代次软骨细胞，离心后先于离心管培养3d，送福建医大电镜室制片观察。经离心管培养3d后，固定标本进行电镜技术观察，原代P0培养软骨细胞为卵圆形或圆形，细胞核清晰，较多异染色质分布于核膜边缘和核内。胞浆内有较多糖原颗粒和分泌囊泡，胞浆内含有丰富的内质网和高尔基体。细胞周围和细胞间可见网络样结构及少量胶原纤维和蛋白聚糖，但是结构较稀疏，排列较乱，缺乏紧密的胶原网络结构。传代后P1软骨细胞体积逐渐增大，胞浆内细胞器减少。细胞外胶原纤维增粗，量变少，蛋白聚糖进一步减少，末发现凋亡软骨细胞。P2代软骨细胞为三角形或卵圆形，细胞核及核仁清晰，少许异染色质沿核膜均匀分布，核内以常染色质为主。胞浆内有较多糖原颗粒和分泌囊泡，内质网和线粒体较丰富。见图2。