大鼠肺成纤维细胞的纯化

背景及概述^[1]

成纤维细胞是疏松结缔组织中最常见而且数量较多的一种细胞，位于胶原纤维近旁并依附于其上。此细胞的形态结构可随其功能状态的不同而改变。在功能活动旺盛时，成纤维细胞的胞体较大，呈扁平星形，有突起。胞核呈卵圆形，核染色质较少，着色浅，核仁明显。胞质较多，弱硷性，内含丰富的粗面内质网、核蛋白体、高尔基复合体以及微丝和微管等结构，表明此种细胞具有合成和分泌胶原蛋白、弹性蛋白和多糖蛋白，形成胶原纤维、弹性纤维、网状纤维和基质的作用。在相对静止或功能活动不活跃时的细胞，称为纤维细胞。这种细胞比成纤维细胞小，轮廓不甚清楚，多呈梭形。胞质少，弱嗜酸性，其中粗面内质网、高尔基复合体及其它细胞器均不发达。这表明纤维细胞是功能活动不活跃的细胞。但在一定条件下，如创伤修复，结缔组织再生时，纤维细胞可转化为功能活跃的成纤维细胞，积极参与合成和分泌蛋白质，形成纤维和基质。

肺成纤维细胞（lungfibroblast，LF）是体内外研究肺纤维化及其他肺部疾病的主要细胞，原代新生大鼠肺成纤维细胞由于直接来源于机体组织，生物性状尚未发生较大的变化，能较好反应体内的生长特性，因此广泛用于药理、毒理、药效试验。

原代培养^[2]

将实验鼠于75%的酒精中窒息处死，无菌条件取出肺脏，用PBS液冲洗，直至肺组织发白，将肺组织剪碎为1mm×1mm×1mm的小块。①组织块法：将剪碎的组织块均匀接种于培养瓶中，2h后待组织块贴于瓶底再加入3mL含10%FBS的RPMI1640培养液。②胰酶法：将剪碎的组织块于37℃用胰蛋白酶消化30min，取上清液，用等量含10%FBS的RPMI1640培养液终止消化、离心，重复多次，将离心后的细胞用RPMI1640培养液培养。③结合法：在组织块中加入2~3mL0.25%胰蛋白酶，静置于37℃、5%CO2培养箱中消化30min，去上清，加入少许含10%FBS的RPMI1640培养液终止消化，将消化后的组织块接种于培养瓶中，小心加入3mL含10%FBS的RPMI1640培养液，倒置放入37℃、5%CO2培养箱1h，待组织块贴紧后将培养瓶翻转继续培养。

纯化^[2]

①差速贴壁法：将消化后的细胞悬浮液以1∶2传代，30min后除去未贴壁的细胞，加入新的RPMI1640培养液继续生长，直到细胞全部为成纤维细胞。②改良法：将细胞及组织块消化后制成细胞悬浮液，倾斜培养瓶，待组织块沉淀后将细胞悬液转移至另一培养瓶中以除去组织块。

形态学观察^[2]

在倒置相差显微镜下观察细胞的形态学变化。选用结合法进行原代培养，3d后镜下观察可见组织块贴壁，组织块周围有梭型、类圆形细胞贴壁生长，5d时可见组织块旁有较多长梭型细胞。10d后细胞接近融合，呈放射状、梭状排列。如图1所示。胰酶法得到的细胞14d时仍未长满，如图2A所示。采用改良纯化法纯化细胞，至第2代，杂细胞基本除去，倒置相差显微镜下可见细胞形态相似、排列具有方向性，生长均匀，在高倍镜下可见单个细胞形态，细胞较大，为梭形、不规则形，呈伪足状，胞体较饱满；至第6代时，镜下可见细胞碎片，细胞内出现较多黑色点状颗粒，为细胞分泌物或老化的细胞器。如图3所示。采用差速贴壁法纯化细胞，第3代时仍可见组织块和内皮细胞。

鉴定^[2]

①HE染色：取对数期细胞，制成单细胞悬液，将悬液一滴一滴接种于6孔板中的盖玻片上，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养，72h后取出细胞爬片。用PBS冲洗3遍，95%乙醇固定30min。苏木素染液染色2~3min，自来水洗涤。镜下观察，用含1%盐酸的酒精溶液分色数秒。然后浸入伊红染液染色1min，自来水洗涤。吹干或自然晾干细胞爬片后，中性树胶封片。②免疫组化染色法：细胞爬片制备方法同HE染色，在每张实验爬片上滴加一滴氧化酶阻断剂，37℃下，3%H2O2孵育10min，PBS清洗标本。水浴锅加热枸橼酸钠磷酸盐缓冲液至95℃，放入细胞爬片加热15min，PBS清洗标本。滴加山羊血清封闭液，在室温下孵育20min。然后滴加一抗，4℃冰箱过夜，PBS冲洗，滴加生物素标记的二抗，37℃孵育0.5h，PBS清洗标本。滴加用辣根过氧化物标记的链霉素卵白素工作液，37℃孵育30min，PBS清洗标本；滴加DAB（3，3'-二氨基联苯胺四盐酸盐），在显微镜下掌握染色程度，自来水冲洗10min终止反应；苏木精复染2min，流水冲洗15min，常规脱水、透明、封片。

将第2代细胞进行HE染色，成纤维细胞呈梭形、星形。细胞核仁呈椭圆形，为单个或多个，清晰可见，胞质呈弱碱性，染色质疏松着色浅，如图5A所示；对第2代肺成纤维细胞进行Vimentin鉴定，显微镜下观察可见细胞内的vimentin呈棕黄色颗粒，细胞核为蓝色，镜下广泛可见，也可见尚未贴壁的成纤维细胞胞体；cytokeratin染色为阴性，如图5B、5C所示。

主要参考资料

[1] 运动解剖学、运动医学大辞典

[2] 新生大鼠肺成纤维细胞的原代培养改良法及细胞鉴定