辣根过氧化物酶（HRP）—迄今为止ELISA中应用最为广泛的标记用酶

HRP是一种分子量达44000的糖蛋白，由无色的酶蛋白和深棕色的铁卟啉结合而成，中性糖和氨基糖约占18％，主要有甘露糖、木糖、阿拉伯糖和己糖胺等。每一个HRP分子中含一个氯化血红素IX作辅基，该辅基在403nm波长处有吸收峰，而去辅基的酶蛋白在275nm波长处有吸收。HRP在403nm的OD值与275nm的OD值之比，也就是所谓的RZ(Reinheits Zahl)值。RZ值仅说明血红素基团在HRP中的含量，并非表示HRP制剂的真正纯度，而且RZ值高的HRP制剂，并不意味着酶活性也高。但可以一纯酶溶液在10mm光径403nm波长下的吸光度来计算酶浓度[1％(W/V)酶溶液吸光度为22.5，浓度为227umol/L]。纯HRP干燥贮存于–20oC可保持稳定，使用1.36 mol/L甘油、10mmol/L磷酸钠、30umol/L牛血清白蛋白和20umol/L细胞色素C(pH 7.4)溶液作为基质冷冻保存，可使酶结合物稳定数年。

HRP对热及有机溶剂的作用比较稳定，用甲苯与石蜡切片处理或用纯乙醇或l0％甲醛水溶液固定做冷冻切片，均不能使其活性改变。氰化物或硫化物在10–5～10–6mol/L浓度时具有可逆性地抑制HRP的作用；氟化物、叠氮化合物或羟胺仅在高于10-3mol／L浓度时抑制HRP；HRP还可被羟甲基过氧化氢不可逆地抑制。强酸也是HRP的强烈的抑制剂。因此，在酶免疫测定常选用上述的某些化合物如氟化钠、叠氮钠和强酸等作为酶反应的终止剂。此外，在配制酶免疫测定的稀释缓冲液时，为防止酶失活，应避免使用叠氮钠作防腐剂。

HRP的同工酶主要可分为三种类型：

①含糖量高的酸性同工酶。

②等电点接近于中性(或微碱)的含糖量相对较低的同工酶。

③含糖量低的碱性(PI>11)同工酶。酶免疫试验中所使用的HRP，以PI为8.7～9.0的所谓“C”同工酶为主要组成成分，其他同工酶的活性则很低。“C”同工酶的共价结构由2个密切接近的区域组成，血红素基团则位于其间而成夹心结构，糖链以8个不同的部位结合于多肽。天然的酶所带的纯电荷极少；无游离的。—氨基，仅有2个可测出的组氨酸，6个赖氨酸似乎全被糖链外壳所遮盖。因此，HRP一般仅有1～2个可用于耦联的氨基。

根据HRP的催化特性，ELISA中一般使用过氧化氢(H2O2)作为HRP底物之一，在供氢体(即色原底物)存在时，HRP与H2O2的反应迅速而又专一。由图4可见，HRP被H2O2二价地氧化形成复合物I，而复合物I又可与氢供体的二步连续的单价相互作用而还原至起始状态。复合物Ⅱ是被氧化的带一个电子的中间产物，当H2O2过量，由于复合物Ⅲ或Ⅳ的形成，酶活性受抑制(以后补上)。

30％的H2O2并不稳定。由于H2O2既为HRP的底物，也为其抑制剂，因而ELISA要想得到满意的测定结果，H2O2必须限定在一定的浓度范围内，终浓度通常为2～6 mmol/L。然而在实际研究工作中，一般很少注意这一点。大多数研究者所使用的H2O2的浓度常较理想反应所需的量大2～4倍。吸附于固相的HRP较游离的HRP更易受过量H2O2的抑制。如果30％H2O2贮存液浓度经测定证实确为30％，则稀释10 000—12 000倍常是较为理想的底物。H2O2的摩尔消光系数为10mm光径240nm波长下为43.6，因此，可通过这种方式来检测H2O2工作溶液的浓度。

固相ELISA中，当温度高于20oC时，HRP活性常较低，在底物溶液中加入非离子去垢剂聚山梨醇-20或TritonX-100可延迟HRP的失活，且可使反应温度加大，但非离子去垢剂的这种酶活性保护效应依氢供体的不同而有差异。如以2,2’-联氮-双-[3-乙基苯并噻唑啉]-6-磺酸(ABTS)为氢供体，则只能保护20％的酶活性，而以邻联茴香胺(ODA)为氢供体时，酶活性的保护提高至90％。

HRP之所以是迄今为止在ELISA中应用最为广泛的标记用酶，主要是因为其一方面易于提取，价格相对低廉；另一方面性质稳定，耐热及有机溶剂的作用，与抗原或抗体偶联后，活性很少受损失。