INVSc1感受态细胞的应用

背景^[1-6]

INVSc1感受态细胞是专门用来做重组蛋白表达的宿主酵母，pYES2质粒与INVSc1酵母配套使用，激活pYES2质粒的GAL1启动子的转录进而启动下游重组蛋白的表达。INVSc1为合子型，可直接通过PEG/LiAc将pYES2质粒转化进入INVSc1细胞内。质粒pYES2的筛选标志为URA，可用SD-URA板进行筛选。INVSc1感受态细胞经特殊工艺制作，-80℃可保存三个月，pYES2质粒检测转化效率>104 cfu/μg DNA。

INVSC1是酿酒酵母菌株，属于真核细胞。一般的针对原核生物的抗生素例如卡那和氨苄对酵母是无效的，因此为了防止大肠杆菌等原核生物对酵母培养菌株污染，往往会在培养基中加入一些氨苄和卡那霉素的抗生素，来抑制细菌菌的污染和生长。

INVSc1感受态细胞操作方法：

1.取100μl冰上融化的INVSc1感受态细胞，依次加入预冷的目的质粒2-5μg，Carrier DNA(95-100℃，5 min，快速冰浴，重复一次)10μl，PEG/LiAc 500μl并吸打几次混匀，30℃水浴30 min(15 min时翻转6-8次混匀)。

2.将管放42℃水浴15 min(7.5 min时翻转6-8次混匀)。

3.5000 rpm离心40 s弃上清，ddH2O 400μl重悬，离心30s弃上清。

4.ddH2O 50μl重悬，涂质粒筛选用：SD-U medium板，29℃培养48-96 h。酿酒酵母适宜的生长温度是28-30度，一般使用30度培养，温度超过32度可能导致细胞的死亡。

INVSC1酿酒酵母是生长快速的双倍体酵母细胞，是蛋白表达的理想菌株。INVSC1酿酒酵母是His,Leu,Trp和Ura营养缺陷型菌株，在缺乏组氨酸，亮氨酸，色氨酸和尿嘧啶的SC minimal media中无法生长。INVSC1酿酒酵母是非常理想的蛋白表达菌株，但是不应该用于遗传分析研究，因为该菌株的孢子形成不好。在制作INVSC1酿酒酵母甘油菌的时候，请不要使用4天以上的平板挑菌保存，尽量使用新鲜的平板。

注意事项：

1.感受态细胞在冰上融化。

2.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

3.INVSc1酵母菌株对高温敏感，最适生长温度为27-30℃；高于31℃，生长速度和转化效率呈指数下降。

应用^[7][8]

INVSc1感受态细胞可用于抗菌肽LfcinB与荧光蛋白在酿酒酵母中的融合表达的研究：

牛乳铁蛋白肽是近年来发现的一种新型抗菌肽,仅含有25个氨基酸,但其抗菌活性是乳铁蛋白的400多倍。为了提高其稳定性,本实验在牛乳铁蛋白肽基因(LfcinB)的C端分别融合了红色荧光蛋白基因(mApple)、绿色荧光蛋白基因(EGFP),构建以mApple/EGFP为报告基因的酵母表达载体,并且成功构建了重组质粒pYES2-α-LfcinB-mApple 和 pYES2-α-LfcinB-EGFP,将其转入酿酒酵母细胞中进行分泌表达。

利用管碟法,检测表达产物对大肠杆菌及金黄色葡萄球菌的抑菌活性;利用激光共聚焦荧光显微镜检测重组细胞内的荧光;利用SDS-PAGE分析目的蛋白的存在。真核表达载体pYES2-α-LfcinB-EGFP电转化到酿酒酵母菌株W303和INVSC1中,均用用含有葡萄糖或者棉子糖的两种SC-U液体培养基,诱导培养重组酿酒酵母菌株W303和菌株INVSC1。

经抑菌实验检测后,发现对于菌株W303来说,当用含有葡萄糖的SC-U液体培养基诱导培养时,其分泌表达的重组蛋白活性更强一些,而INVSC1菌株无论是含葡萄糖还是棉子糖的SC-U液体培养基进行培养,其抑菌活性相差无几。而重组酵母W303作为宿主菌分泌表达重组蛋白的抑菌活性普遍高于酿酒酵母菌株INVSC1,且所需诱导时间更短。

重组蛋白LfcinB-mApple/LfcinB-EGFP对大肠杆菌DH5α和金黄色葡萄球菌都表现出了明显的抑菌活性,且重组蛋白的分泌对重组酵母细胞的生长未产生不利影响。在实验组重组酵母细胞中均观察到明显荧光,且对照组无荧光出现。但SDS-PAGE检测后,未发现目的蛋白。分析结果原因一是目的蛋白被水解,二是融合蛋白发生多个糖基化位点修饰,由于抗菌肽产量较低,因此难以检测到明显蛋白条带。

参考文献

[1]Effects of antimicrobial peptides (AMPs) on blood biochemical parameters, antioxidase activity, and immune function in the common carp (Cyprinus carpio)[J] . Xiao-Qing Dong,Dong-Ming Zhang,Yu-Ke Chen,Qiu-Ju Wang,Yi-Yu Yang.  Fish and Shellfish Immunology . 2015 (1)

[2]Antimicrobial peptides: Possible anti-infective agents[J] . Jayaram Lakshmaiah Narayana,Jyh-Yih Chen.  Peptides . 2015

[3]Expression, Purification, and Antibacterial Activity of Bovine Lactoferrampin–Lactoferricin in Pichia pastoris[J] . Xiang-Shan Tang,Zhi-Ru Tang,Sheng-Ping Wang,Ze-Meng Feng,Dong Zhou,Tie-Jun Li,Yu-Long Yin.  Applied Biochemistry and Biotechnology . 2012 (3)

[4]Expression and Purification of an Antimicrobial Peptide, Bovine Lactoferricin Derivative LfcinB-W10 in Escherichia coli[J] . Xingjun Feng,Chunlong Liu,Jiayin Guo,Chongpeng Bi,Baojing Cheng,Zhongyu Li,Anshan Shan,Zhongqiu Li.  Current Microbiology . 2010 (3)

[5]Lactoferricin[J] . J. L. Gifford,H. N. Hunter,H. J. Vogel.  Cellular and Molecular Life Sciences . 2005 (22)

[6]The heterologous expression strategies of antimicrobial peptides in microbial systems. DENG T,GE H R,HE H H. Protein Expression and Purification . 2017

[7] A bimodal cationic and water-soluble Calix arene conjugate design synthesis characterization and transfection of red fluorescent protein encoded plasmid in cancer cells. SAMANTA K,RANADE D S,UPADHYAY A et al. ACS Appl Mater Interfaces . 2017

[8]荣慧杰,查向东,孔小卫,葛嫚嫚,张旭冉.抗菌肽LfcinB与红色荧光蛋白mApple在酿酒酵母中的融合表达[J].中国生物制品学杂志,2018,31(11):1192-1196.