GV3101感受态细胞的应用

背景^[1-6]

GV3101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱性Ti质粒pMP90(pTiC58DT-DNA)，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必须的元件，pMP90(pTiC58DT-DNA)质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但是可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。

pMP90(pTiC58DT-DNA)型Ti质粒含有筛选标签：Strep和gent。赋予GV3101菌株链霉素和庆大霉素抗性，适用于拟南芥、烟草、玉米、土豆等植物的转基因操作，经植物双元pCambia2301M质粒检测，转化效率可达103cfu/μg。-80℃保存几个月转化效率不发生改变。

所谓的感受态,就是指易于吸收外源DNA的状态,感受态细胞是指经过处理（一般用CaCl溶液处理即可)后处于能够吸收外源DNA的状态的细胞.在基因工程中,当受体细胞是植物时,可以选用农杆菌转化法,花粉管通道法和基因枪法；而受体细胞是动物细胞时,一般选用显微注射法；当受体细胞是微生物时,才用感受态的方法.所以质粒也可以成为感受态细胞。

GV3101感受态细胞操作方法（采用冻融法）：

1.取-80℃保存的GV3101农杆菌感受态细胞于冰上或室温融化。

2.在无菌条件下，向刚刚化冻的感受态细胞悬液中加入1μg需要转化的质粒DNA，轻轻混匀，冰水浴中静置10min。

3.将离心管置于液氮中速冻5min。（也可以用干冰和无水乙醇混合物代替液氮）

4.快速将离心管置于37℃水浴中保持5min，不要晃动水面。

5.将离心管放回冰水浴中，再保持5min。

6.无菌条件下加入800μl无抗生素的2×YT或LB液体培养基，于28℃震荡培养2~3小时。目的是使菌体复苏并表达抗生素抗性。

7.5000rpm离心1min收菌，留取100μl左右上清轻轻吹打重悬菌体，加到相应抗生素的LB固体培养基平板上，用无菌的细菌涂布器或玻璃珠将细胞均匀涂开。等平板中的液体完全吸收后，倒置平板，28℃培养2-3天。

注意事项：

1.感受态细胞在冰上融化。

2.混入质粒时应轻柔操作。

3.转化高浓度的质粒可相应减少最终用于涂板的菌量。

应用^[7][8]

GV3101感受态细胞可用于农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株：

红曲菌发酵产物中含有一种胆固醇合成抑制剂-Monacolin K,它与土曲霉中发现的lovastatin系同一物质,都具有抑制生物体内胆固醇合成途径中关键酶HMG-CoA还原酶活性的作用,从而调节生物体内异常血脂,由于历史上红曲产品具有可直接食用的特性,因此含Monacolin K的红曲产品更为消费者接受和喜爱。

建立根癌农杆菌介导转化红曲菌的方法,将携带遗传标记的T-DNA插入红曲菌基因组中,改变红曲菌遗传信息的排列,影响其生长和代谢,筛选高产Monacolin K突变转化子;从高产Monacolin K红曲菌突变株基因组中,根据已知的T-DNA两端保守序列,扩增出T-DNA插入位点侧翼序列,从而寻找影响Monacolin K合成的带T-DNA标签的突变基因,为研究红曲菌Monacolin K合成功能基因组及代谢调控提供基础信息;通过原生质体融合的方式选育红曲菌Monacolin K高产株并研究适合于遗传改造变异株高产Monacolin K的发酵工艺,为红曲菌工业化生产Monacolin K打下基础。

构建了含有gpdA启动子、潮霉素抗性基因hph和trpC终止子的双元载体pCAMBIA 3300-gpdA-hph-trpC并转入根癌农杆菌GV3101;利用根癌农杆菌介导转化技术成功将潮霉素抗性基因转入发白红曲菌(M.albidus)9901,实验优化了抗生素浓度,发白红曲菌孢子浓度,根癌农杆菌细胞密度,共培养温度和时间,以及乙酰丁香酮浓度等转化条件,最终转化效率可达520个转化子/10~6个红曲孢子。

对转化子进行潮霉素抗性基因PCR鉴定,结果进一步证实外源T-DNA已整合至转化子的染色体基因组中。在诸多转化子中,通过发酵实验筛选得到了一株比出发菌株发白红曲菌9901高产Monacolin K的T-DNA插入突变转化子H1。采用反向PCR方法对发白红曲菌转化子H1基因组T-DNA插入位点侧翼序列进行克隆,获得了一段0.88 kb的DNA片段,暂命名为mkWL,对DNA片段mkWL进行测序,通过与NCBI公布的丛毛红曲菌Monacolin K合成基因簇比对分析,发现与其中mkH基因(1.46 kb)部分基因序列同源性为97%。由此推断基因mkWL包含发白红曲菌Monacolin K合成关联基因。

参考文献

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[2]Relation between growth,respirometric analysis and biopigments production from Monascus by solid-state fermentation.de Carvalho J C,Pandey A,Oishi B O,et al.Biochemical Engineering Journal.2006

[3]Antibiotics inhibiting the biosynthesis of cholesterol.Trenin A S,Katrukha G S.Pharmaceutical Chemistry Journal.1997

[4]Biosynthesis of hypocholesterolemic agent mevinolin by Aspergillus terreus.Moore R,Bigan G,Chan J.Journal of the American Ceramic Society.1985

[5]Revision of the biosynthetic origin of oxgens in mevinolin,a hypocholesterolemic drug from Aspergillus terreus MF4845.Yoshizawa Y,Witter D,Liu Y.Journal of the American Ceramic Society.1994

[6]Azaphilone pigments from a yellow mutant of the fungus Monascus kaoliang.Jongrungruangchok S,Kittakoop P,Yonsmith B,et al.Phytochemistry.2004

[7]Citrinin mycotoxin-chemical.Vladimir B.Biological and Environmental Aspects.1989

[8]王璐.农杆菌介导转化及原生质体融合法选育红曲菌Monacolin K高产株[D].江南大学,2011.