AGL1感受态细胞的应用

背景^[1-6]

AGL1 Electro感受态细胞是以为C58,RecA型背景，核基因中含有筛选标签—利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pTiBo542DT-DNA，此质粒含有vir基因（vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能被破坏，但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移）。

AGL1菌株适用于水稻、拟南芥、杨树等植物的转基因操作。唯地生物开发的AGL1电转感受态特别适用于大质粒的转化：经pCAMBIA2301质粒(size:11633bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA；经pCAMBIA2301-ZH质粒(size:40kd)检测转化效率可达5×103 cfu/μg DNA。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour inducing)质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA(Transferring DNA)，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中，并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。

选择一种特制的空质粒载体（如PBI121质粒载体），其上要求含有T-DNA边界序列（此处可参见词条双元表达载体系统），在序列之间含有复制原点、抗性基因、GUS报告基因、HindⅢ和BamH I等酶切位点（以上这些构成了一个T-DNA区）。先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因，再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因，从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。

农杆菌转化法的原理是构建双元表达载体系统，由两种质粒组成，一种是位于大肠杆菌中的穿梭质粒，另一种是位于农杆菌中的辅助性质粒。将重组质粒电转化到农杆菌感受态细胞中后，用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物根部切口，通过辅助性质粒的Vir区表达蛋白与重组质粒T-DNA区（目的片段）的反式作用激活T-DNA的转移（此处可参见词条双元表达载体系统），从而将目的片段整合到植物细胞基因组中。随着愈伤组织的形成，使得新生细胞均含有该目的片段的基因。

应用^[7][8]

AGL1感受态细胞可用于农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物检测研究：

在实验室已初步建立的农杆菌EHA105介导银耳转基因方法的基础上,以银耳潮霉素敏感菌株Tr21-01为出发菌株,通过冻融法将携带有潮霉素磷酸转移酶(Hph)基因为遗传标记及人胰岛素基因(BAC)为目的基因的质粒pBHg-BCA导入根癌农杆菌GV3101,LBA4404和AGL-1中,并进一步介导转化银耳进行研究。

实验结果发现:AGL-1具有较高的转化率;GV3101转化率较低,且假阳性较高;LBA4404无抗性菌落长出。此结果表明不同的农杆菌侵染银耳芽孢能力具有差异性,且对受体侵染具有一定的特异性。本实验以农杆菌EHA105为参照菌株,对农杆菌AGL-1介导转化银耳进行研究。基于农杆菌介导转基因受诸多因素的影响,本实验从农杆菌与银耳芽孢共培养时间、银耳芽孢浓度、农杆菌浓度、诱导剂乙酰丁香酮(AS)的浓度、转化菌株阳性比率等方面进行优化。

其转化条件优化结果为:AGL-1菌液OD值为0.4～0.5,AS诱导培养浓度为250μg/mL、共培养浓度为150μg/mL,银耳芽孢浓度为10~8/mL,共培养72h转化率最高,可达500个/10~8,且阳性菌落为89%;EHA105菌液OD值为0.4～0.5,AS诱导培养浓度为200μg/mL,共培养浓度为200μg/mL,银耳芽孢浓度为10~8/mL,共培养48h转化率最高,可达380个/10~8,且阳性菌落为83%。通过比较发现AGL-1比EHA105有更高的转化率。

通过上述转基因方法,我们筛选到大量转化子,随机挑选26株转化子通过ITS,Hph基因及BCA基因进行DNA水平验证,同时随机选取6株进行Hph基因和BCA基因的cDNA水平验证。实验结果表明:我们选取的转化子都为阳性菌株,并且检测到Hph基因和BCA基因的mRNA。通过对60株转基因菌株利用ELISA法对BCA目的基因进行初步检测,结果表明部分菌株可以检测到表达目的BCA基因的表达产物。进一步分析我们检测得到的有目的BCA基因表达菌株发现,其潮霉素抗性很高,大部分潮霉素抗性达350μg/mL。此结果说明目BCA基因的表达与抗性基因Hph表达存在一定关系。

参考文献

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