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AGL1感受态细胞的应用

发布日期:2020/4/28 7:22:22

背景[1-6]

AGL1 Electro感受态细胞是以为C58,RecA型背景,核基因中含有筛选标签—利福平抗性基因rif和羧苄青霉素抗性基因carb,为了便于转化操作,此菌株携带一无自身转运功能的琥珀碱型Ti质粒pTiBo542DT-DNA,此质粒含有vir基因(vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件,pTiBo542DT-DNA质粒自身的T-DNA转移功能被破坏,但可以帮助转入的双元载体T-DNA顺利转移)。

AGL1菌株适用于水稻、拟南芥、杨树等植物的转基因操作。唯地生物开发的AGL1电转感受态特别适用于大质粒的转化:经pCAMBIA2301质粒(size:11633bp)检测转化效率>105 cfu/μg DNA;经pCAMBIA2301-ZH质粒(size:40kd)检测转化效率可达5×103 cfu/μg DNA。根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti(Tumour inducing)质粒和Ri质粒,其上有一段T-DNA(Transferring DNA),农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后,可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减数分裂稳定的遗传给后代,这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。

选择一种特制的空质粒载体(如PBI121质粒载体),其上要求含有T-DNA边界序列(此处可参见词条双元表达载体系统),在序列之间含有复制原点、抗性基因、GUS报告基因、HindⅢ和BamH I等酶切位点(以上这些构成了一个T-DNA区)。先通过双酶切反应酶切空质粒载体和目的基因,再通过酶连反应连接空质粒载体和目的基因,从而构建成完整的重组质粒。此时重组质粒的T-DNA区包括T-DNA边界序列、复制原点、突变启动子片段、GUS报告基因、抗性基因。

农杆菌转化法的原理是构建双元表达载体系统,由两种质粒组成,一种是位于大肠杆菌中的穿梭质粒,另一种是位于农杆菌中的辅助性质粒。将重组质粒电转化到农杆菌感受态细胞中后,用含有重组质粒的农杆菌去侵染植物根部切口,通过辅助性质粒的Vir区表达蛋白与重组质粒T-DNA区(目的片段)的反式作用激活T-DNA的转移(此处可参见词条双元表达载体系统),从而将目的片段整合到植物细胞基因组中。随着愈伤组织的形成,使得新生细胞均含有该目的片段的基因。

应用[7][8]

AGL1感受态细胞可用于农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物检测研究:

在实验室已初步建立的农杆菌EHA105介导银耳转基因方法的基础上,以银耳潮霉素敏感菌株Tr21-01为出发菌株,通过冻融法将携带有潮霉素磷酸转移酶(Hph)基因为遗传标记及人胰岛素基因(BAC)为目的基因的质粒pBHg-BCA导入根癌农杆菌GV3101,LBA4404和AGL-1中,并进一步介导转化银耳进行研究。

实验结果发现:AGL-1具有较高的转化率;GV3101转化率较低,且假阳性较高;LBA4404无抗性菌落长出。此结果表明不同的农杆菌侵染银耳芽孢能力具有差异性,且对受体侵染具有一定的特异性。本实验以农杆菌EHA105为参照菌株,对农杆菌AGL-1介导转化银耳进行研究。基于农杆菌介导转基因受诸多因素的影响,本实验从农杆菌与银耳芽孢共培养时间、银耳芽孢浓度、农杆菌浓度、诱导剂乙酰丁香酮(AS)的浓度、转化菌株阳性比率等方面进行优化。

其转化条件优化结果为:AGL-1菌液OD值为0.4~0.5,AS诱导培养浓度为250μg/mL、共培养浓度为150μg/mL,银耳芽孢浓度为10~8/mL,共培养72h转化率最高,可达500个/10~8,且阳性菌落为89%;EHA105菌液OD值为0.4~0.5,AS诱导培养浓度为200μg/mL,共培养浓度为200μg/mL,银耳芽孢浓度为10~8/mL,共培养48h转化率最高,可达380个/10~8,且阳性菌落为83%。通过比较发现AGL-1比EHA105有更高的转化率。

通过上述转基因方法,我们筛选到大量转化子,随机挑选26株转化子通过ITS,Hph基因及BCA基因进行DNA水平验证,同时随机选取6株进行Hph基因和BCA基因的cDNA水平验证。实验结果表明:我们选取的转化子都为阳性菌株,并且检测到Hph基因和BCA基因的mRNA。通过对60株转基因菌株利用ELISA法对BCA目的基因进行初步检测,结果表明部分菌株可以检测到表达目的BCA基因的表达产物。进一步分析我们检测得到的有目的BCA基因表达菌株发现,其潮霉素抗性很高,大部分潮霉素抗性达350μg/mL。此结果说明目BCA基因的表达与抗性基因Hph表达存在一定关系。

参考文献

[1]Expression of a Ricin Toxin B Subunit:Insulin Fusion Protein in Edible Plant Tissues[J].James E.Carter,Oludare Odumosu,William H.R.Langridge.Molecular Biotechnology.2010(2)

[2]A novel multi-array immunoassay device for tumor markers based on insert-plug model of piezoelectric immunosensor[J].Bo Zhang,Xue Zhang,Hui-hui Yan,Shi-jun Xu,Dai-hua Tang,Wei-ling Fu.Biosensors and Bioelectronics.2007(1)

[3]Development and validation of a sensitive and fast chemiluminescent enzyme immunoassay for the detection of genetically modified maize[J].A.Roda,M.Mirasoli,M.Guardigli,E.Michelini,P.Simoni,M.Magliulo.Analytical and Bioanalytical Chemistry.2006(6)

[4]Isolation and transformation of uracil auxotrophs of the edible basidiomycete Pleurotus ostreatus[J].Beom-Gi Kim,Yumi Magae,Young-Bok Yoo,Suk-Tae Kwon.FEMS Microbiology Letters.1999(2)

[5]Isolation and transformation of uracil auxotrophs of the edible basidiomycete Pleurotus ostreatus.Beom-Gi Kim,Yumi Magae,Young-Bok Yoo,et al.FEMS Microbiology Letters.1999

[6]Mullins ED,et al.Phytopathology.2001

[7]Time2resolved Fluoroimmunoassay for Human InsulinBased on Two Monoclonal Antibody[J].STORCH MJ,MARBACH P,KERPL A.Journal of Immunological Methods.1993

[8]张文瑞.不同农杆菌介导人胰岛素基因转化银耳及ELISA法检测表达产物[D].福建农林大学,2011.

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