SuperBlock(PBS)Blocking Buffer的应用

背景^[1-6]

SuperBlock(PBS)Blocking Buffer是一种含有单一纯化的糖蛋白的阻断试剂，可为ELISA，IHC和蛋白质印迹分析提供极其快速有效的阻断。

SuperBlock阻断缓冲液的特点：

1快速-在5到10分钟内阻断膜，在2分钟内阻断ELISA板

2灵活-保证不含生物素，与链霉抗生物素蛋白系统一起

3低背景-非血清蛋白质溶液产生高信噪比

4稳定-储存缓冲液在4°C下保存一年;储存块板干燥长达12个月 

使用SuperBlock缓冲液阻挡微板，膜或组织可在大多数检测系统中产生高信噪比。基于蛋白质的配方不含任何免疫球蛋白，白蛋白或内源性生物素，使其在许多传统阻断剂失效的情况下兼容。缓冲剂在封闭涂覆的聚苯乙烯微孔板（96孔板）和稳定它们以便干燥和储存以备后用时特别有效。SuperBlock(PBS)阻断缓冲液优于牛奶，可灵敏检测目标蛋白。

通过SDS-PAGE分离HeLa细胞裂解物（20,10,5,2.5,1.25,0.625和0.3125μg），并转移至硝酸纤维素或PVDF膜。使用含有0.05％Tween*-20洗涤剂的Tris缓冲盐水或含有0.05％Tween-20洗涤剂的磷酸盐缓冲盐水中的SuperBlock封闭缓冲液，将膜封闭1小时。探测膜的指示目标。将印迹在Thermo Scientific SuperSignal West Pico化学发光底物中温育5分钟并暴露于膜上。

应用^[7][8]

用于ELISA，免疫组织化学和蛋白质印迹封闭阻断。

卵巢癌是世界范围内最致命的妇科恶性疾病之一,由于缺乏典型的临床症状、特异的体征及肿瘤标志物等有效的筛查手段,绝大多数卵巢癌病人在得到诊断时已处于晚期,使其死亡率高居妇科恶性肿瘤首位。肿瘤的转移能力有赖于细胞的迁移与侵袭,然而决定肿瘤转移能力的分子机制目前仍然不十分清楚。因此,努力探索调控卵巢癌细胞转移潜能的分子靶标将至关重要。Hedgehog(Hh)信号通路在细胞命运决定以及细胞增殖过程中发挥重要作用。

该通路由Hh配体,膜受体Ptch和跨膜信号转导蛋白Smo以及参与Hh信号转导的胞浆蛋白复合体组成,其级联传导的末点被公认为锌指转录因子Gli(Glioma-associated oncogene transcription factors),是该信号通路的关键节点,在信号转导中起枢纽作用。Hh靶基因涉及细胞增殖、细胞存活、细胞分化、细胞周期以及干细胞形成和细胞侵袭等多方面。

有研究发现：卵巢癌中Hedgehog(Hh)信号通路异常活化,但信号通路异常活化与卵巢癌侵袭、转移的关系有待进一步明晰。方法：部分人上皮性卵巢癌组织中Hedgehog信号通路异常活化与临床病理特征的关系(1)为了证实在卵巢癌中存在Hh信号通路的异常活化,我们采用免疫组化技术检测了65例卵巢癌病人卵巢肿瘤组织石蜡切片中Hh信号通路重要组分蛋白Gli2的表达情况,并且在此基础上将Gli2的表达情况与卵巢癌的临床病理特征进行了相关性分析。(2)同时,通过Western-blot及real-time PCR等方法检测卵巢癌及正常卵巢组织中Hh信号通路重要组分蛋白Shh、Gli1、Gli2等的蛋白水平及mRNA水平的表达情况。

第二部分抑制Hedgehog信号通路降低卵巢癌细胞增殖与迁移能力(1)为了探索Hh信号通路与卵巢癌细胞增殖与迁移能力的关系,我们以卵巢癌细胞系(SKO-V3和ES-2)为研究对象,采用转录因子Gli特异性小分子抑制剂GANT61处理SKO-V3和ES-2细胞,对加药处理(实验组加30μM GANT61,对照组加等体积的DMSO)的SKO-V3和ES-2细胞通过Western-blot、real-time PCR及免疫细胞化学方法在蛋白水平以及mRNA水平检测了Hh信号通路中相关组分,如跨膜受体Smo,终末转录因子Gli1和Gli2的表达情况。

采用real-time PCR和Western blot分别对芯片发现的富集于某些信号通路的差异基因以及相关基因(如ITGB4、FAK、CD24、MMP7等)在mRNA水平和蛋白水平进行验证,以确认芯片结果的可靠性。Western blot结果显示：实验组裸鼠皮下移植瘤中Gli1和Gli2蛋白表达水平明显低于对照组裸鼠,相对定量结果提示差异有极显著统计学意义,(p<0.01)；免疫组织化学法检测实验组裸鼠及对照组裸鼠皮下移植瘤中ITGB4及p-FAK的蛋白表达水平,结果显示实验组相比对照组瘤体中ITGB4及p-FAK的蛋白表达水平明显下降。

参考文献

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[8]陈琦.Hedgehog信号通路与卵巢癌侵袭转移关系的实验研究[D].南昌大学,2013.