Pierce Silver Stain for Mass Spectrometry的应用

背景^[1-6]

Pierce Silver Stain for Mass Spectrometry是目前来说用于检测和观察蛋白最灵敏的显色方法。这种技术利用银离子能够强烈的结合到某些蛋白功能集团上，比如羧酸集团(Asp和Glu),咪唑(His),硫氢基(Cys),以及氨基(Lys)。

在显色溶液的帮助下，银离子还原成银金属从而出现了可视化的条带。既然这种技术提供最高的灵敏度(它可以用于检测低于1ng的蛋白)同时对于涉及到微量蛋白的应用来说会非常有用,同时它在使用中也有很多缺点。

包括如下:

Pierce Silver Stain是时间和劳动密集型的。染色过程涉及多个步骤和试剂，凝胶染色之后需要加入显色剂。因为显色需要的时间在各个胶之间变动很大，使用这个技术不能保证在定量分析中足够的重复性。狭窄的线性动力学范围。这使得银染不是非常适合进行定量。不能染色所有的蛋白。银染不好的地方在于不能对于常见翻译后的蛋白修饰，比如糖蛋白和磷酸化蛋白进行染色。对于下游的应用提供有限的兼容性。传统的银染要求使用戊二醛或甲醛，这些化学物质能够导致凝胶中蛋白的化学交联。这限制了兼容方法的数量用于质谱分析。最新的质谱兼容银染方法已经有商用的产品能够提供更大的兼容性，但是仍然和传统的银染方法一样有相同的缺点。

Pierce Silver Stain用于SDS-PAGE、非变性PAGE或2D电泳胶上进行蛋白银染，经过消除液处理后，去除附着蛋白质和胶上的银粒，再经过原位酶解、脱盐等蛋白质质谱样品制备布置后就可以用于质谱分析。本试剂盒具有低背景和检测灵敏度高等特点，可在3小时内完成银染及染色后胶内银粒子的清除。用BSA蛋白检测灵敏度可以达到0.5 ng。

应用^[7][8]

用于肺癌早诊蛋白质谱的筛查鉴定及SWI/SNF染色质重组复合物失调研究。

肺癌包括小细胞肺癌(SCLC)的和非小细胞肺癌,后者约占所有肺癌类型的80%。肺癌是全球癌症相关死亡的首要病因,因为大多数肺癌在诊断时已经出现晚期转移。最近的研究表明,肺癌患者的外周血中存在肿瘤相关的特异性抗原的自身抗体,可用来作为一种肺癌早期检测的生物标志物。材料与方法:我们用20例非小细胞肺癌组织标本(Ⅰ至IV期)构建了一个噬菌体展示文库。然后用肺癌患者和正常健康对照血清对这个文库进行生物淘洗富集和血清免疫学分析。

噬菌体表达肿瘤相关蛋白的初步挑选是建立在患者与正常健康对照组患者的血清抗体的亲和力差别的基础上。噬菌体表达蛋白的基因序列确认后,从非小细胞肺癌细胞株和组织标本的基因芯片中可以查找那些读码框内表达蛋白对应的基因表达水平。表达上调的基因编码的噬菌体表达蛋白被选定用于酶联免疫吸附测定(ELISA)。我们进一步用40例非小细胞肺癌患者和36例健康对照组血清来检测这些肿瘤相关自身抗体的有效性。

逻辑回归模型(Logistic regression models)和弃一交叉验证法(Leave-one-out cross validation)被用来评估单一和联合标志物预测肺癌能力,而后一种统计方法也用于分析这些标志物与疾病分期的关系。

材料与方法:

(1)来自吸烟者与非吸烟者的101例肺癌细胞株和83例非小细胞肺癌及配对良性肺组织样本用于此项研究。

(2)应用NextGen测序和Sanger测序技术用于对肺癌细胞株DNA的SWI/SNF染色质重组复合物基因进行测序。

(3)应用Western Blot技术检测肺癌细胞株核蛋白提取物中部分SWI/SNF染色质重组复合物的蛋白表达水平。

(4)应用化学诱导甲基化用于检测BRM蛋白缺失的细胞株。

(5)应用基因芯片用于检测肺癌细胞株和组织样本中全基因组基因的表达水平。

(6)应用单核苷酸多态性芯片分析用于检测肺癌细胞株和组织样本中全基因组基因的拷贝数变化。

(7)应用免疫组化芯片染色用于对肺癌组织中BRG1和BAF250a的表达进行分析。

参考文献

[1]Loss of expression of the SWI/SNF chromatin remodeling subunit BRG1/SMARCA4 is frequently observed in intraductal papillary mucinous neoplasms of the pancreas[J]。Marco Dal Molin,Seung-Mo Hong,Sachidanand Hebbar,Rajni Sharma,Francesca Scrimieri,Roeland F。de Wilde,Skye C。Mayo,Michael Goggins,Christopher L。Wolfgang,Richard D。Schulick,Ming-Tseh Lin,James R。Eshleman,Ralph H。Hruban,Anirban Maitra,Hanno Matthaei。Human Pathology。2012(4)

[2]Mapping the High Throughput SEREX Technology Screening for Novel Tumor Antigens[J]。Shengtao Zhou,Tao Yi,Boya Zhang,Fuqiang Huang,Huiqiong Huang,Jing Tang,Xia Zhao。Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening。2012(3)

[3]Immune responses to malignancies[J]。Theresa L。Whiteside。The Journal of Allergy and Clinical Immunology。2010(2)

[4]SWI/SNF complexes,chromatin remodeling and skeletal myogenesis:It’s time to exchange![J]。Sonia Albini,Pier Lorenzo Puri。Experimental Cell Research。2010(18)

[5]Autoimmunity to SOX2,clinical phenotype and survival in patients with small-cell lung cancer[J]。Paul Maddison,Alison Thorpe,Paul Silcocks,John F。R。Robertson,Caroline J。Chapman。Lung Cancer。2010(3)

[6]Immunogenicity of SEREX-identified antigens and disease outcome in pancreatic cancer[J]。Cancer Immunology,Immunotherapy。2010(9)

[7]Serum autoantibodies as biomarkers for early cancer detection[J]。Hwee TongTan,JiayiLow,Seng GeeLim,Maxey C。M。Chung。FEBS Journal。2009(23)

[8]姚毅冰。肺癌早诊蛋白质谱的筛查鉴定及SWI/SNF染色质重组复合物失调研究[D]。天津医科大学,2012。