乳酸脱氢酶的检测方法

背景及概述^[1]

乳酸脱氢酶是与氧化型辅酶Ⅰ(MADI)为氢受体，催化L-乳酸与丙酮酸之间可逆反应的一种脱氢酶。其是由4条多肽链组成。该酶广泛存在于各种组织中，以心肌、肝、骨骼肌、肺含量最多，其活力约为血清的500～1000倍。若器官或组织损伤，可释放此酶至血液中，血清此酶含量即见增高，但由于其分布广泛而缺乏特异性。血清此酶含量升高主要见于急性心肌梗塞、病毒性心肌炎、肝硬化、肺梗塞、恶性肿瘤及白血病等。在急性心肌梗塞患者，血清此酶水平于发作后12～24小时开始增高，48～72小时达高峰，升高可持续10天。与肌酸激酶相比该酶升高出现较晚，阳性率低，但维持时间长。该酶和谷-草转氨酶联合检测有助于鉴别心肌梗塞，两者均升高多见于心肌梗塞；乳酸脱氢酶和胆红质升高，而谷-草转氨酶正常多见于肺梗塞。

临床意义^[2]

(1)急性心肌梗塞发作后，早期血清中乳酸脱氢酶1和乳酸脱氢酶2活性均升高，但乳酸脱氢酶1增高更早，更明显，导致乳酸脱氢酶1/乳酸脱氢酶2的比值升高。

(2)肝炎、急性肝细胞损伤及骨骼肌损伤时乳酸脱氢酶5都会升高。

(3)患活动性风湿性心脏病、急性病毒性心肌炎、溶血性贫血、肾坏死等病乳酸脱氢酶1也可升高。

制备^[3]

一种海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法具体包括以下步骤：

(1)将产生乳酸脱氢酶的海洋微生物进行6～10次活化，再经过定向驯化4～6次，使其在培养条件下生长良好；

(2)按常规方法将定向驯化后的乳酸脱氢酶产生菌在12～18℃培养24～36h而后按5～8％的接种量进行逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；

(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的4～10％接种量接入液体发酵培养基中，在12～18℃培养24～60h时，即海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶结束；

(4)将(3)的发酵液在6，000～8，000rpm离心收集液体，用蒸馏水洗涤数次之后离心收集沉淀；

(5)将沉淀悬浮于缓冲液中，加石英砂研磨破碎，10，000～14，000rpm离心，收集到的上清为乳酸脱氢酶粗酶液；

(6)根据不同需要和使用对象不同，将(5)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

检测方法^[4]

在酶的生产和应用过程中，经常要进行酶的活力测定，以确定酶量的多少及其变化情况。酶活力测定方法多种多样，总的要求是快速、简便、准确。酶活力的测定均包括两个阶段，首先要在一定的条件下，酶与底物反应一段时间，然后再测定反应液中底物或产物变化的量。乳酸脱氢酶测定方法很多，根据酶作用的反应可分为二大类一类利用顺向反应以乳酸为基质另一类利用逆向反应，以丙酮酸为基质。根据测定方法不同又可分为可见分光光度法和紫外分光光度法。可见分光光度法利用2，4一二硝基苯麟和丙酮酸作用，生成丙酮酸二硝基苯踪，在碱性溶液中呈棕色，在520nm处光吸收峰最高。取试管加入0.5mol/l乳酸钠溶液0.5ml，酶液0.1ml，空白管加蒸馏水，37℃水浴保温3min。然后测试管中加入NADH1mmol/l0.1ml，37℃水浴保温15mn。加入2，4-，二硝基苯肼，37℃水浴保温15min，加入氢氧化钠溶液终止反应，静置显色而后处比色，通过标准曲线计算酶活。酶活单位规定：1min催化乳酸生成丙酮酸的酶量为个酶活力单位(U)。

主要参考资料

[1] 心脏病学词典

[2] CN201210567475.X一种制备乳酸脱氢酶的方法及应用

[3] CN201210108709.4海洋微生物发酵生产乳酸脱氢酶的方法

[4] 乳酸脱氢酶的制备及其固定化研究