米屈肼(二水合物)的作用机制

背景及概述^[1]

目前，临床常用的防治心肌缺血药主要有硝酸酯类、β受体阻滞剂、钙通道阻滞剂及中草药等。它们的作用机制主要是增加心肌血液供应；降低氧耗；保护缺血心肌细胞，使细胞浆膜线粒体和核膜免受损伤；改善心肌代谢，增加营养底物的供应和渗入缺血区。近年来，改善心肌代谢的药物在抗心肌缺血再灌注损伤方面的作用受到诸多学者的重视。心肌代谢改善药是指在心肌细胞水平，通过改善心肌的代谢而增加心肌对缺血和或再灌性损伤的耐受性。故具有明显的心肌保护作用，并对血流动力学参数无明显影响，心脏供血和心脏氧耗亦无明显变化。鉴于此类药与其他抗心肌缺血药的明显区别，亦称为细胞抗缺血药。

米屈肼(mildronate，又称THP，MET-88)是一种新型心脏保护药，是卡尼汀的结构类似物，化学名为3-(2，2，2-三甲基联氨)丙酸盐二水合物(米屈肼(二水合物)。　米屈肼作用部位在线粒体，在细胞水平改善心肌能量代谢。由拉托维亚有机合成所研制，1989年由Grindeks公司首次在前苏联上市销售，有胶囊(250，500mg)和注射剂(500mg·mL-1)2种剂型。

作用机制

米屈肼是肉毒碱的结构类似物，能竞争抑制丁酸甜菜碱羟化酶，从而抑制肉毒碱的生物合成，直接抑制肉毒碱依赖的脂肪酸在线粒体的转运。抑制肉毒碱的生物合成可减少细胞内游离肉毒碱的浓度，防止异丙肾上腺素诱导的酰基肉毒碱堆积。

1. 膜保护作用 创伤和烧伤后细胞膜极不稳定，这是由于刺激引起的长链酰基肉毒碱堆积对细胞膜(包括溶酶体膜)产生的有害作用造成的。因此减少长链酰基肉毒碱的堆积对细胞膜和溶酶体膜起到稳定作用，而有利于受损细胞的恢复。这种膜保护作用除了对创伤和烧伤后细胞有利外，对缺血损伤的心肌细胞也同样有利。缺血引起心肌细胞的应激反应，使线粒体内脂肪酸分解增加，细胞中脂肪酸代谢物堆积，细胞膜结构遭到破坏，细胞内Ca2+增加。米屈肼的膜稳定作用可保护心肌细胞肌浆网上Ca2+-ATP酶(SERCA2)对钙的摄取，改善心肌梗死引起的SERCA2和己糖激酶Ⅰ丢失，从而减少心肌缺血造成的组织损伤，缓解血液动力学功能障碍。

2. 能量优化作用 　米屈肼可减少长链酰基肉毒碱的堆积，从而可抑制肉毒碱依赖的脂肪酸氧化，使缺氧心肌的能量代谢从脂肪酸氧化转化为更有利的葡萄糖氧化，即促使糖酵解途径的厌氧性氧化，故本品具有抗缺氧效用和心脏保护活性。另外，米屈肼还能抑制肉毒碱乙酰转移酶，因此可提高线粒体内各种代谢途径对乙酰CoA的利用率，防止ATP和ADP浓度的下降、以及防止丙肾上腺素引起的AMP堆积与能量的降低，起到心肌保护作用。

3. 抑制能量代谢酶  米屈肼还能阻止异丙肾上腺素诱导加强的血中乳酸脱氢酶(心肌特异同工酶)肝脏异生活性，防止肌酸磷酸激酶活性的增加。测定心脏线粒体电子传递活性发现，异丙肾上腺素对琥珀酸细胞色素C还原酶的影响不大，但明显减少NADH细胞色素C还原酶和细胞色素C氧化酶。连续服用米屈肼7d可以削弱异丙肾上腺素的这种作用。线粒体的电子传递系统在细胞的能量转化中扮演着重要的角色。由异丙肾上腺素诱导的线粒体功能紊乱，与肉毒碱依赖的脂肪酸代谢有关，而米屈肼能够减少肉毒碱依赖的脂肪酸代谢，防止异丙肾上腺素引起的线粒体功能紊乱，也减少心肌的损害。

4. 促进肉毒碱的排泄  米屈肼在体内除竞争性抑制丁酸甜菜碱羟化酶，阻断肉毒碱生物合成外，还竞争性的影响肉毒碱在肾脏的重吸收。研究还发现，米屈肼降低心脏肉毒碱浓度主要不是通过抑制肉毒碱在心脏的转运或代谢，而是增加肾脏对肉毒碱的清除，可能是通过抑制其重吸收，降低血清中游离肉毒碱的浓度起到保护心脏作用。

药理作用

1. 抗心肌缺血　心肌缺血能够引起心肌梗死，其最终结果是引起心衰。从发病机制方面已证实，通过降低细胞内肉毒碱浓度来抑制肉毒碱依赖的脂肪酸代谢，可对抗缺血而造成的心肌损伤，从而有效保护心肌。米屈肼可减少豚鼠心肌游离肉毒碱含量，从而减轻缺氧和再灌注损伤。进一步研究表明，米屈肼在缺氧状态下能降低大鼠心肌收缩压和大动脉血流。同时还能防止缺氧灌注30min后的高能磷酸减少和长链肉毒酰的增加。另外，米屈肼可使缺氧灌注后的大鼠心脏糖氧化更稳定。在两项独立的研究中，均采用阻塞大鼠冠状动脉左前降支引起实验性心肌梗死，再应用米屈肼进行治疗的方法。

在缺血区域，阻塞的前降支不仅降低了组织水平的ATP，ADP和肌磷酸，还增加了组织水平的AMP和乳酸盐。结果都表明给予米屈肼能阻止ATP和ADP的减少(分别为35%和37%)，阻止腺嘌呤核苷酸的降低(30%)，缓解缺血心肌的能量代谢紊乱，而不影响非缺血心肌的能量代谢。实验结果表明米屈肼可抑制脂肪酸的beta-氧化从而对缺血心肌的能量代谢是非常有利的。另一动物模型研究显示，米屈肼对心肌缺血前的心功能没有影响，而硝苯吡啶可显著增加冠脉血流。在缺血状态下，心功能显著降低；再灌注期间，米屈肼和硝苯吡啶都能改善心功能并降低心室纤颤的发生。米屈肼还能防止缺血引起的长链肉毒酰堆积，有利于保护缺氧心脏。

2. 抗心衰　米屈肼可改善充血性心力衰竭引起的大鼠心脏舒张功能的紊乱。米屈肼100mg·kg-1可以改善大鼠因充血性心力衰竭造成的心肌高能磷酸水平的损害。米屈肼可改善心衰大鼠心肌能量状态，增加心脏对高负荷的适应性，从而减小心衰大鼠右心房高压，防止左心室腔的膨胀(心室重构)，改善心肌梗死诱发的充血性心力衰竭症状。100mg·kg-1·d-1米屈肼的疗效与20mg·kg-1的卡托普利相当。治疗剂量的米屈肼对杂种狗的窦房结节律性和心房收缩性没有直接的影响，但大剂量有轻微的抑制作用。一项应用交叉循环(cross-overcirculation)的方法发现，米屈肼能使狗的冠脉扩张而增加冠状血流。另一项研究表明，米屈肼对猫的心肌保护作用是通过稳定主要的血液动力学参数来阻止急性缺氧致心衰的发生。临床研究证明，对于Ⅰ～Ⅲ级心绞痛患者，米屈肼对改善冠状血流是有益的。

毒理学研究

1. 急性毒理学　昆明种小鼠静脉注射米屈肼，即刻出现中毒症状，表现为挣扎、颤抖、尿失禁、呼吸抑制至死亡。静脉给药的LD50为5719.87mg·kg-1，(95%可信限为5298.92～6134.96mg·kg-1)。未死亡动物10～30min后活动、行为表现及一般状况逐渐恢复正常，解剖检查未见异常变化。灌胃给药后10～30min开始出现中毒症状，表现为步态不稳、竖毛、活动减少、卷缩、颤抖、呼吸抑制、死亡，多发生在药后1～3d，存活动物的活动、行为表现及一般状况在次日逐渐恢复正常，LD50为18696.77mg·kg-1，(95%可信限为17170～20870mg·kg-1)，解剖检查未见异常。

2. 长期毒性 　大鼠经口给药，当剂量在20，100和500mg·kg-1时，实验动物的一般行为状态、实验室检查指标、器官重量及组织病理学检查均未见严重的、不可逆的毒性反应。预计该药临床拟用剂量(约15mg·kg-1)是安全的。家兔和狗静脉注射给药，连续1个月，对实验动物的体重、造血功能、肝肾功能、及心电图未见影响。家兔实验设30，150和750mg·kg-1·d-1共3个剂量组，未见对心节律或心脏电生理特性有不良影响；狗实验设100，300和1000mg·kg-1·d-1共3个剂量组，未见心脏传导及收缩受到影响，300mg·kg-1剂量组中一些狗的肝脏和或肾脏实质出血现象，但此现象似乎没有剂量相关性。

3. 致畸作用　在大鼠胚胎器官形成期6～15d，连续静注米屈肼1667，833和250mg·kg-1(分别为人用剂量的100，50，15倍)。结果表明，米屈肼在250mg·kg-1剂量下无生殖毒性及致畸作用。

4. 致突变和致癌作用 　对S.typhimurium每碟给予米屈肼1000mg，没有发现点突变和移码突变。米屈肼处理的雌果蝇Mosaicpatches与对照组突变频率相当。雌性B6D2F1，C3H，SHR小鼠用米屈肼慢性治疗没有出现肿瘤，C3H，SHR小鼠乳腺癌的发展受到轻微抑制，这与米屈肼的抗促性腺激素作用相关。实验说明，米屈肼在3个种属小鼠的短期和长期用药均没有致突变和致癌作用。

药动学

以大鼠进行药动学及生物转化的研究，结果表明，分别以2，20，60mg·kg-1的剂量经口给药和静注给药时，该药的动力学性质是非线性的，在20和60mg·kg-1剂量时，血浆中MET-88的放射性曲线与总放射性曲线相一致，而剂量为2mg·kg-1时，血浆中MET-88的放射性明显比总放射性低。放射性排泄实验表明，经口给药时，该药主要经尿液排泄，血浆中的主要代谢物为葡萄糖、琥珀酸和3-羟基丙酸。体外研究表明，MET-88可被γ-丁内铵盐羟化酶转化为3-羟基丙酸。利用可捕获CO2气体的离体肝脏灌注模型研究了MET-88的排泄过程，加入碘代乙酸、DL-氟代柠檬酸或γ-丁内铵盐可使产生的[14C]CO2减少，对灌注液进行的薄层色谱分析表明，MET-88先被γ-丁内铵盐羟化酶转化为3-羟基丙酸，然后被生物合成为葡萄糖，再通过糖酵解和三羧酸循环代谢并释放出CO2。该药的血浆蛋白结合率可忽略不计，半衰期3～6h。

临床评价

对一组心功能Ⅰ～Ⅱ级的心绞痛患者静脉注射250mg米屈肼，各项血液动力学指数如W值，W0及心脏收缩频率、心脏在负荷过程中的收缩压、对物理负荷的谐振指示器和脉冲调幅，在给药后均有显著的增加。另一组心功能Ⅲ级的心绞痛患者在服用同等剂量后与给药前相比血液动力学指数有所改善。从接受米屈肼治疗起，10例患者的发病频率从每昼夜15～20次降为每昼夜6～7次，2例者未发生心绞痛。停服后，所有患者的症状又恢复到原来的状态。服用米屈肼不仅能增加冠状血流，而且还能改善心肌的新陈代谢。在利用综合疗法治疗慢性心脏局部缺血和并发性心脏功能不全时，米屈肼治疗的患者心脏血液动力明显改善。对54例年龄在45～65岁一直伴有Ⅱ～Ⅲ级心绞痛、梗死后心脏硬化和Ⅰ～Ⅱ级脏功能不全的慢性心脏局部缺血症患者进行了研究。血红蛋白配位光谱的研究结果证明，与对照组相比，慢性心脏局部缺血症患者的血液中血红蛋白含量有很大的增加。

制备^[1]

一种米屈肼二水合物制备方法技术方案为，包括以下步骤：

1）碱解后水溶液的制备：取3000克强碱性阴离子树脂，装入大小合适的树脂柱内，按照树脂的处理方法，将其活化好，并升温至40℃-45℃，备用。取100克3-（2，2，2-三甲基肼基）丙酸甲酯的硫酸盐加入到1000克纯化水中混合均匀，升温至35℃-40℃。然后将此水溶液过已经备好的装有3000克强碱性阴离子树脂的柱子，过柱液循环过柱直至HPLC检测碱解反应完全，收集过柱液。用1000克纯化水淋洗树脂柱以淋洗下附着在树脂上的物料。合并过柱液，在烧瓶内减压浓缩至体积为50ml-100ml，得到碱解后水溶液。

2）析晶前米屈肼水溶液的制备：取10克强碱性阴离子树脂，装入大小合适的树脂柱内，按照树脂的处理方法，将其活化好，备用。取10克弱酸性阳离子树脂，将其活化好备用。将上步制备的碱解后水溶液过已经备好的装有10克强碱性阴离子树脂的树脂柱，收集过柱液。用10克纯化水淋洗树脂柱以淋洗下附着在树脂上的物料。合并过柱液，用弱酸性阳离子树脂调节过柱液的PH至7.0-8.0，先用滤纸再用0.22微米滤膜过滤除去阳离子树脂，得到析晶前米屈肼水溶液。

3）可用于注射的米屈肼二水合物的制备：将上步制备的析晶前米屈肼水溶液于烧瓶内减压浓缩至近干，烧瓶中的残留物中加入浓度为90%的乙醇80克，搅拌升温至60℃-70℃，取样测定水分后，并跟据检测结果补加纯化水至体系的水分为13%-15%。然后加入活性炭0.3克，搅拌30分钟后，过滤，先用滤纸再用0.22微米滤膜过滤，所得滤液在搅拌下降温至-10℃-5℃，过滤，滤饼减压烘干，得到白色结晶性粉末即为纯净的米屈肼二水合物（82克，摩尔收率94%），纯度≥99.9%（HPLC面积归一化法），水分19.8%，碱度7.51，氯化物＜0.01%，炽灼残渣0.04%，硫酸盐＜0.05%，细菌内毒素＜0.35IU/mg。

将得到白色结晶性粉末做红外光谱分析，可以证明该白色结晶性粉末为米屈肼，由水分含量19.8%可知，该产物为米屈肼二水合物。

主要参考资料

[1]心肌能量代谢改善药米屈肼

[2]CN201610283393.0一种米屈肼注射液及其制备方法

[3]CN201310387770.1一种米屈肼二水合物制备方法