硫酸辛可尼丁的应用

背景及概述^[1]

金鸡纳树皮中的一种生物碱。辛可宁的立体异构体。有左旋光性。熔点210℃。难溶于水，溶于乙醇。硫酸辛可尼丁三水物是针状晶体。溶于水和乙醇。无水物熔点约240℃(分解)。与奎宁相像，具有抗疟作用。可在金鸡纳树皮提取液中分出奎宁后，母液以碱处理，析出生物碱，加入酒石酸使其成为难溶的酒石酸盐分离而得。

应用

硫酸辛可尼丁对肿瘤细胞生长的影响，硫酸辛可尼丁可以促进肿瘤细胞凋亡，以抑制肿瘤细胞生长，促进肿瘤的早期凋亡，并增强了促进细胞凋亡因子的表达，抑制了抑制凋亡因子的表达。硫酸辛可尼丁有望于今后在抗肿瘤方面应用。

1.硫酸辛可尼丁对肿瘤细胞生长的影响：用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养子宫颈癌细胞系HeLa细胞、人乳腺腺癌上皮细胞系MCF7细胞和人肺癌细胞系A549细胞系，分别以4600个/孔的细胞密度接种到96孔板，培养24小时(h)后，分别加入1，5，10，50，100，250μmol/L浓度的辛可宁丁，分别培养48h，72h和96h后用MTT法测细胞生长状况，其结果显示硫酸辛可尼丁有浓度依存性地抑制HeLa细胞的生长。

MTT法：每孔加入5mg/ml的MTT溶液20μl，培养箱中孵育3小时后取出，弃去上清，每孔加150μl二甲基亚砜溶解甲瓒沉淀，用酶标仪在490nm下测定吸光度值。实验结果表明硫酸辛可尼丁可以抑制HeLa细胞(A)，MCF7细胞(B)和A549细胞(C)，表明硫酸辛可尼丁有抗肿瘤活性。

2.早期细胞凋亡的检测-流式细胞：为了研究辛可宁抑制肿瘤细胞生长的机制，进一步探讨了它们对HeLa细胞的早期细胞凋亡的影响。方法如下：用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养HeLa细胞，接种于6cm细胞培养皿，调整细胞密度，培养24h后，加硫酸辛可尼丁时细胞密度在40％左右，分别加入100，150，180μmol/L浓度的辛可宁，分别作用48h后用流式细胞术测定细胞早期凋亡。

流式细胞术：培养细胞与6cm细胞培养皿中，加辛可宁刺激后，收集细胞，PBS洗2遍，1500-2000rpm离心5min，弃去上清，加入BindingBuffer100μl，磷脂酰丝氨酸结合蛋白(AnnexinV)-FITC5μl，碘化丙啶(PI)5μl，室温暗处反应30min后，加400μlBindingBuffer，上样检测细胞早期凋亡。结果显示硫酸辛可尼丁提高了HeLa细胞的AnnexinV和PI的表达，表明硫酸辛可尼丁能促进肿瘤细胞的早期凋亡。

3.泛素化Akt(Ub-Akt)和磷酸化Akt(p-Akt)的检测：

LPS可以促进Akt泛素化和磷酸化，为了探讨硫酸辛可尼丁的作用途径，我们研究了化合物能否阻止Akt的泛素化和磷酸化。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养HeLa细胞，接种于6cm细胞培养皿中，调整细胞密度，使加化合物时细胞密度达到70％-80％，加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分别刺激1、2和3h。然后加20μg/ml的LPS刺激3h后，提取总蛋白。用ProteinASepharosebeads沉淀Akt蛋白，Westernblot法检测泛素化Akt的变化，以β-actin作为内参蛋白。加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分别刺激3、6、12和24h。然后加20μg/ml的LPS刺激3h后，提取总蛋白。用Westernblot法测定磷酸化Akt的变化，以β-actin作为内参蛋白。

Western：提取细胞总蛋白，应用BCA蛋白定量法得出提取蛋白的浓度，按每孔40μg上样。吸取蛋白样品，按1：4比例加入5×loadingbuffer，煮沸10min，上样，跑SDS电泳，80V，20min，120V，1h。电泳结束后，用半干转转印槽于23V，转印1h。取出PVDF膜，TBST洗6次，每次5min，5％脱脂奶粉封闭2h。转入5％BSA稀释的p-Akt(308/473)、Akt、泛素化抗体或β-actin抗体中，4℃摇过夜。第二天，取出PVDF膜，TBST洗膜后转入5％脱脂牛奶稀释的通用二抗中，孵育40min，TBST洗40-50min，加入eECL，反应1-2min，暗室曝光。结果显示，硫酸辛可尼丁可以有效地阻止LPS引起的Akt的泛素化和磷酸化。

4.泛素化TAK1(Ub-TAK1)和磷酸化TAK1(p-TAK1)的检测：

LPS可以促进TAK1泛素化和磷酸化，为了探讨硫酸辛可尼丁的作用途径，研究了化合物能否阻止TAK1的泛素化和磷酸化。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养HeLa细胞，接种于6cm细胞培养皿中，调整细胞密度，使加化合物时细胞密度达到70％-80％，加180μmol/L的硫酸辛可尼丁分别刺激3、6、12和24h。然后加1μg/ml的LPS刺激15min后，提取总蛋白。用ProteinASepharosebeads沉淀TAK1蛋白，Westernblot法检测泛素化TAK1的变化，以β-actin作为内参蛋白。结果显示，硫酸辛可尼丁可以有效地阻止LPS引起的TAK1的泛素化和磷酸化。

5.细胞凋亡相关因子的检测(Bax/Bcl)：

探讨化合物对细胞凋亡相关因子Bax和Bcl的表达。用含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基培养HeLa细胞(购自沈阳万类生物科技有限公司)，接种于6cm细胞培养皿中，调整细胞密度，培养24h后，加辛可宁时细胞密度在40％左右。每皿细胞加入180μmol/L的辛可宁，分别刺激12h、24h、48h、72h、96h。提取细胞总蛋白，用Westernblot法检测细胞凋亡相关因子Bax/Bcl的表达。

结果显示从加硫酸辛可尼丁24h后Bax的表达有所提高，而Bcl的表达被抑制，48h后此现象更加明显，Bax是凋亡促进蛋白，而Bcl是凋亡抑制蛋白，此结果进一步支持硫酸辛可尼丁促进了细胞凋亡。

主要参考资料

[1] 简明精细化工大辞典

[2] CN201710142634.4硫酸辛可尼丁在制备抗肿瘤药物的用途