六胜肽的合成

背景及概述^[1][2]

六胜肽又称六元胜肽，它广泛分布于人体各处，是人体自身存在且必须的活性物质，它具有肉毒素的全部功能，但避免了肉毒素必须采用注射应用方式和使用成本高昂的缺点。六胜肽现已成为风靡世界的抗皱化妆品原料，许多高端化妆品均应用了六胜肽成分用于抗皱。瑞士传奇集团护肤实验室于2010年研发的MAGIC CARE魔法护理六胜肽平皱紧致原液是六胜肽美容产品的尖端代表。

纯化^[1]

1、溶样

将100g固相合成所得六胜肽粗品溶解于1000ml水溶液中，用氨水调节pH值至8.5， 超声分散，待溶液完全澄清，用4号砂芯漏斗过滤，收集滤液。

2、纯化

用反相高效液相色谱法对滤液进行纯化，填料是F型粒径为30～50μm的SBC MCI GEI反相色谱填料(由成都科谱生物有限公司提供)的反相聚合物柱，柱子填装体积为 3000mL。进样前反相聚合物色谱柱先用pH8.5的水溶液(用氨水调节pH)平衡至检测器的电 导率恒定不变，上样，上样量为100g，然后用碱性流动相冲洗100min，冲洗时碱性流动相A与 碱性流动相B的比例为99:1，碱性流动相A为pH值为pH8.5(用氨水调节pH的甲醇溶液，碱性流动相B为Ph8.5的甲醇溶液，流速为50ml/min，柱温40℃。

用碱性流动相冲洗结束后再用酸性流动相酸性梯度洗脱得到醋酸六胜肽以去除六胜肽粗品中的杂质，酸性流动相A为含有 1％(体积百分比)醋酸的水溶液，酸性流动相B为含有1％(体积百分比)醋酸的甲醇溶液，流 速为50ml/min，流动相梯度选择0到100分钟酸性流动相A:酸性流动相B由99:1到95:5，然后 用酸性流动相A和酸性流动相B恒流洗脱(酸性流动相A:酸性流动相B的比例为95:5)，柱温 为40℃，检测波长为215nm,收集纯化后的醋酸六胜肽溶液，将纯化后的醋酸六胜肽溶液在 40℃减压旋蒸浓缩，冷冻干燥，得到纯度大于95％的醋酸六胜肽，六胜肽的纯化收率为 72％。其质谱表征结果见图1，色谱图见图2。

合成^[2]

目前，六胜肽的合成方法主要采用经典固相法合成。即将保护氨基酸由C端向 N端逐个延伸，通过缩合、脱除保护、再缩合、切割树脂、离心、冻干和高效液相制备得到纯度高于90%的六胜肽产品。该方法中所需要的树脂市场价格较为昂贵，且其交换活度小，并且在合成中使用的溶剂种类多、且反应试剂量均明显过量，造 成了六胜肽原料成本的增高。作为化妆品原料，目前六胜肽的市场价格大约为1000 元/g，致使含有六胜肽的化妆品成品价格昂贵，使普通人群难以接受，因此，降低六胜肽生产成本的工艺方法研究具有重要意义。

CN201310593375.9克服上述六胜肽固相合成方法的缺点，采用液 相合成方法提供一种工艺方法简单、产品成本低、溶剂易于回收、对环境友好的六 胜肽的合成方法。解决上述技术问题所采用的技术方案由下述步骤组成：

1、合成AcOSu

将N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL 混合均匀，加入二异丙基乙胺，搅拌，冰浴降温至0～5℃，滴加乙酰氯，保持溶液温度小于20℃，N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚与二异丙基乙胺、乙酰氯的摩尔比为1:1.1～1.5:1.05～1.5，滴加完后撤去冰浴，自然升至室温反应2～3小时，分离纯化产物，得到AcOSu。

2、合成Ac-Glu(OtBu)-OH

将AcOSu与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:4～6mL混合，室 温搅拌至溶解；将γ-叔丁酯谷氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到 AcOSu的四氢呋喃溶液或AcOSu的1,4-二氧六环溶液中，AcOSu与γ-叔丁酯谷氨 酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.3:1.5～3，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的 体积比为2～3:1，室温搅拌反应5～8小时，反应液减压浓缩至粘稠状，冷却至5～10℃，用质量分数为20%的柠檬酸水溶液调节pH值至2～3，5～10℃静置2～3小 时，过滤，滤饼经水洗、干燥，得到Ac-Glu(OtBu)-OH。

3、合成Ac-Glu(OtBu)-COOSu

将Ac-Glu(OtBu)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:8～10mL 混合均匀，加入N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，室温搅拌至溶解，加入二环己 基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚、二环己基碳 二亚胺的摩尔比为1:1.0～1.5:1.2～1.5，室温搅拌反应5～6小时，过滤除去固体不溶物，得到Ac-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-COOSu的1,4- 二氧六环溶液。

4、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH

将γ-叔丁酯谷氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤3得到的 Ac-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液中，Ac-Glu(OtBu)-OH与γ-叔丁酯谷氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1～2:1，室温搅拌反应8～10小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH。

5、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu

将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为 1g:8～10mL混合均匀，加入N-羟基丁二酰亚胺或对硝基苯酚，室温搅拌至溶解， 加入二环己基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与N-羟基丁二酰亚胺或对硝 基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为1:1.0～1.5:1.2～1.5，室温搅拌反应5～6 小时，过滤除去固体不溶物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶 液或Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的1,4-二氧六环溶液。

6、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH

将蛋氨酸和碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤5得到的 Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu的四氢呋喃溶液或Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-COOSu 的1,4-二氧六环溶液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-OH与蛋氨酸、碳酸氢钠的摩尔比 为1:1.0～1.2:1.5～3.0，蒸馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1:1～2，室 温搅拌反应8～10小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH。

7、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp

将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL 混合，室温搅拌至溶解，加入对硝基苯酚，搅拌至溶解，加入二环己基碳二亚胺，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-OH与对硝基苯酚、二环己基碳二亚胺的摩尔比为 1:1.1～1.3:1.2～1.5，室温反应6～8小时，分离纯化产物，得到 Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp。

8、合成Fmoc-Gln(Trt)-COOSu

将Fmoc-Gln(Trt)-OH与四氢呋喃或1,4-二氧六环按质量-体积比为1g:8～10mL 混合，室温搅拌至溶解，加入N-羟基丁二酰亚胺，搅拌至溶解，加入二环己基碳 二亚胺，Fmoc-Gln(Trt)-OH与N-羟基丁二酰亚胺、二环己基碳二亚胺的摩尔比为 1:1.0～1.3:1.2～1.5，室温反应5～8小时，过滤除去固体不溶物，得到 Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的四氢呋喃溶液或Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环溶液。

9、合成Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH

将精氨酸与碳酸氢钠溶解于蒸馏水中，所得溶液滴加到步骤8得到的 Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的四氢呋喃溶液或Fmoc-Gln(Trt)-COOSu的1,4-二氧六环溶 液中，Fmoc-Gln(Trt)-OH与精氨酸、碳酸氢钠的摩尔比为1:1.0～1.2:1.5～3.0，蒸 馏水与四氢呋喃或1,4-二氧六环的体积比为1:1～3，室温搅拌反应10～12小时， 分离纯化产物，得到Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH。

10、合成H2N-Gln(Trt)-Arg-OH

将Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与二氯甲烷按质量-体积比为1g:8～10mL混合均匀，搅拌，加入哌啶或二乙胺，Fmoc-Gln(Trt)-Arg-OH与哌啶或二乙胺的摩尔比为1:3～5，室温搅拌反应20～24小时，分离纯化产物，得到H2N-Gln(Trt)-Arg-OH。

11、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH

将步骤7得到的Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与N,N-二甲基甲酰胺按 质量-体积比为1g:6～8mL混合均匀，加入步骤10得到的H2N-Gln(Trt)-Arg-OH， 室温搅拌至溶解；将碳酸氢钠溶于蒸馏水中，所得溶液滴加到H2N-Gln(Trt)-Arg-OH 与Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp的N,N-二甲基甲酰胺溶液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-COONp与H2N-Gln(Trt)-Arg-OH、碳酸氢钠的摩尔比 为1:1.0～1.2:1.5～3，N,N-二甲基甲酰胺与蒸馏水的体积比为3～5:1，室温搅拌反 应20～24小时，分离纯化产物，得到Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH。

12、合成Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2

将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH与N,N－二甲基甲酰胺按质量-体 积比为1g:10～12mL混合，室温搅拌至溶解，依次加入二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-OH 与二环己基碳二亚胺、1-羟基苯并三唑、H-Arg-NH2·2HCl、N-甲基吗啉的摩尔比为 1:1.2～1.5:1.2～1.5:1.5～2:5～10，室温搅拌36～48小时，分离纯化产物，得到 Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2。

13、制备六胜肽

将Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2加入二氯甲烷与三氟乙 酸的体积比为1:1的混合液中，Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2 与混合液的质量-体积比为1g:10～16mL，室温搅拌至溶解，加入三异丙基硅烷， Ac-Glu(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Gln(Trt)-Arg-Arg-NH2与三异丙基硅烷的摩尔比为 1:5～10，室温搅拌反应4～6小时，分离纯化产物，得到六胜肽。

主要参考资料

[1] CN201710004413.0 一种低成本纯化六胜肽的方法

[2] CN201310593375.9 一种六胜肽的液相分段合成方法