大鼠原代毛囊角质细胞

背景^[1-6]

大鼠原代毛囊角质细胞是一种不断分化的复层鳞状上皮细胞，其分化的最终阶是形成角蛋白。根据角质形成细胞的发展阶段和特点，从内向外可将其分为五层。基底细胞层又称生发层，棘细胞层，颗粒层，透明层，角质层。角质形成细胞的分化成熟表现为从基底层到向角质层的逐渐移行。在单一移行过程中，角质形成;细胞的形状和功能也逐渐发生着变化，从单层柱状上皮的基底层到扁平的细胞核消失的角质层。

新生的基底细胞进入棘细胞层，然后上移到颗粒层的最上层。大鼠毛囊干细胞生长状况良好,CK15、CD34、β1-整合素(CD29)表达阳性,成骨诱导后茜素红染色阳性、成脂诱导后油红O阳性,此3组间细胞活率差异无显著性意义(P>0.05)。生长曲线显示：生长速度角质细胞无血清培养基+体积分数10%胎牛血清>DMEM/F12培养+体积分数10%胎牛血清>角质细胞无血清培养基(P<0.05)。

DMEM/F12+10%胎牛血清组中CK15、CD34、β1-整合素(CD29)表达均低于其他2组(P<0.05),角质细胞无血清培养基组CD34的表达高于角质细胞无血清培养基+10%胎牛血清组(P<0.05),β1-整合素(CD29)及CK15则无统计学差异。结论：使用上述方法培养的大鼠毛囊干细胞生长状况良好,具有毛囊干细胞表面标志物,并具有多向分化能力。角质细胞无血清培养基较DMEM/F12+10%胎牛血清能培养出纯度更高的毛囊干细胞,且在此培养基基础上加入胎牛血清,能够促进细胞的增殖。

细胞特性:

1细胞来源于实验大鼠的正常皮肤组织。

2细胞鉴定：广谱角蛋白((Pan Cytokeratin)免疫荧光染色为阳性。

3经鉴定细胞纯度高于90%。

4不含有HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌。

5细胞生长方式：上皮样细胞，贴壁培养。

应用^[7][8]

大鼠原代毛囊角质细胞用于角质细胞特异性Pten基因敲除导致小鼠毛囊干细胞动员加快的研究：

毛囊干细胞位于毛囊隆突内,是维持成体皮肤稳态和毛发再生的重要基础。毛囊干细胞自我更新和分化之间平衡的保持是毛囊干细胞发挥功能的关键。两者间平衡的破坏会引起皮肤肿瘤或者干细胞耗竭的发生。WNT/β-catenin和BMP信号通路在毛囊干细胞分化和动员过程中发挥重要作用。PTEN(10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源物)通过使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(PIP3)去磷酸化,抑制PI3K/AKT信号通路多个信号分子的活化。其中最重要的一个效应分子是AKT,AKT的活化会导致细胞周期加快,细胞凋亡抑制以及蛋白翻译增加等。

在其它组织干细胞中的研究表明,Pten基因对多种干细胞的维持非常重要,但Pten基因是否在毛囊干细胞动员和维持中发挥作用,却未见相关报道。通过免疫组化发现,PTEN在表皮角质细胞和毛囊干细胞中表达,提示PTEN可能在毛囊干细胞动员和维持中发挥作用。通过检测AKT磷酸化的水平,发现在Pten基因敲除小鼠的表皮和包括隆突在内的整个毛囊中AKT磷酸化水平显著升高。

Pten基因敲除小鼠毛囊生长期提前,静息期缩短,毛囊周期加快,同时表皮显著增厚,角质细胞增殖增加。短期核苷酸类似物BrdU(bromodeoxyuridine)标记滞留实验能够显示出表皮和毛囊增殖旺盛的区域。给出生后23天小鼠,连续3天分3次腹腔注射BrdU,滞留34天后检测BrdU信号。结果表明在毛囊峡部和表皮基底层等细胞增殖比较旺盛的部分,Pten基因敲除小鼠的标记滞留细胞显著减少。

为研究Pten基因敲除对毛囊干细胞数量的影响,我们检测了两种常用的毛囊干细胞标记分子K15和CD34在对照和Pten基因敲除小鼠静息期毛囊中的表达情况。结果发现Pten基因敲除小鼠与对照小鼠相比,每个静息期毛囊中CD34和K15表达没有发生显著改变。流式细胞术检测发现,与对照小鼠相比,Pten基因敲除小鼠毛囊干细胞在表皮所有角质细胞中的比例下降(8.74%±1%vs 6.78±0.7%,p<0.01,n=3)。流式细胞术与原位检测之间产生差异的主要原因是Pten基因敲除小鼠表皮增厚,角质细胞数量增加,因此毛囊干细胞的比例会下降。

参考文献

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[2]NFATc1 Balances Quiescence and Proliferation of Skin Stem Cells[J].Valerie Horsley,Antonios O.Aliprantis,Lisa Polak,Laurie H.Glimcher,Elaine Fuchs.Cell.2008(2)

[3]Blimp1 Defines a Progenitor Population that Governs Cellular Input to the Sebaceous Gland[J].Valerie Horsley,Dónal O’Carroll,Reuben Tooze,Yasuhide Ohinata,Mitinori Saitou,Tetyana Obukhanych,Michel Nussenzweig,Alexander Tarakhovsky,Elaine Fuchs.Cell.2006(3)

[4]Transcriptional control of epidermal specification and differentiation[J].Xing Dai,Julia A Segre.Current Opinion in Genetics&Development.2004(5)

[5]Self-Renewal,Multipotency,and the Existence of Two Cell Populations within an Epithelial Stem Cell Niche[J].Cedric Blanpain,William E.Lowry,Andrea Geoghegan,Lisa Polak,Elaine Fuchs.Cell.2004(5)

[6]PTENless means more[J].Bangyan Stiles,Matthias Groszer,Shunyou Wang,Jing Jiao,Hong Wu.Developmental Biology.2004(2)

[7]Hair cycle regulation of Hedgehog signal reception[J].Anthony E Oro,Kay Higgins.Developmental Biology.2003(2)

[8]王丽娟.角质细胞特异性Pten基因敲除导致小鼠毛囊干细胞动员加快[D].中国人民解放军军事医学科学院,2010.