大鼠胰岛素样生长因子(IGF)ELISA试剂盒

背景^[1-6]

大鼠胰岛素样生长因子(IGF)ELISA试剂盒应用双抗体夹心法测定标本中大鼠胰岛素样生长因子(IGF)水平。

用纯化的大鼠胰岛素样生长因子-1(IGF-1)抗体包被微孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入胰岛素样生长因子(IGF)，再与HRP标记的胰岛素样生长因子(IGF)抗体结合，形成抗体-抗原-酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物TMB显色。TMB在HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的胰岛素样生长因子(IGF)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），通过标准曲线计算样品中大鼠胰岛素样生长因子(IGF)浓度。

标本要求：

1．标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能马上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融

2．不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。大鼠胰岛素样生长因子(IGF)Elisa试剂盒

操作步骤：

1.标准品的稀释：本试剂盒提供原倍标准品一支，用户可按照下列图表在小试管中进行稀释。

2.加样：分别设空白孔（空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同）、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品准确加样50μl，待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl（样品最终稀释度为5倍）。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。

3.温育：用封板膜封板后置37℃温育30分钟。

4.配液：将30倍浓缩洗涤液用蒸馏水30倍稀释后备用

5.洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。

6.加酶：每孔加入酶标试剂50μl，空白孔除外。

7.温育：操作同3。

8.洗涤：操作同5。

9.显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟.

10.终止：每孔加终止液50μl，终止反应（此时蓝色立转黄色）。

11.测定：以空白空调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度（OD值）。测定应在加终止液后15分钟以内进行。

注意事项：

1．试剂盒从冷藏环境中取出应在室温平衡15-30分钟后方可使用，酶标包被板开封后如未用完，板条应装入密封袋中保存。

2．浓洗涤液可能会有结晶析出，稀释时可在水浴中加温助溶，洗涤时不影响结果。

3．各步加样均应使用加样器，并经常校对其准确性，以避免试验误差。一次加样时间控制在5分钟内，如标本数量多，推荐使用排枪加样。

4．请每次测定的同时做标准曲线，做复孔。如标本中待测物质含量过高（样本OD值大于标准品孔孔的OD值），请先用样品稀释液稀释一定倍数（n倍）后再测定，计算时请最后乘以总稀释倍数（×n×5）。

5．封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。

6．底物请避光保存。

应用^[7][8]

大鼠胰岛素样生长因子(IGF)ELISA试剂盒可用于在高糖条件下对大鼠胰岛功能及凋亡影响的研究：

胰岛素样生长因子-1(IGF-1)在高糖条件下对大鼠胰岛细胞功能的影响及对胰岛细胞凋亡的作用机制。方法:按体外培养SD大鼠胰岛的培养液不同,分为三组:对照组(葡萄糖5.6mmol/l)、高糖组(葡萄糖15.6mmol/l)、IGF-1组(葡萄糖15.6mmol/l+IGF-110ng/ml)培养48小时,检测:采用放免法和免疫组化法检测胰岛分泌功能;采用Hoechst33342免疫荧光细胞核染色、TUNEL法和电镜观察胰岛细胞凋亡水平;采用免疫组化法检测抗凋亡因子Bcl-2的表达率。

结果:与对照组相比,高糖组的胰岛素分泌量、细胞内胰岛素表达率明显减少(P＜0.05);凋亡细胞明显增多(P＜0.05);抗凋亡因子Bcl-2表达率明显减少(P＜0.05);Hoechst33342荧光染色高糖组细胞核碎裂、核固缩多见;电镜观察高糖组胰岛β细胞核仁消失,核膜变形,分泌颗粒明显较减少,在β细胞周围及毛细血管间有淀粉样物质沉着。

IGF-1组胰岛素分泌量、细胞内胰岛素表达率均明显高于对照组及高糖组(P＜0.05);胰岛细胞凋亡率较高糖组明显下降但仍高于对照组(P＜0.05);抗凋亡因子Bcl-2表达率较高糖组增加但低于对照组(P＜0.05);Hoechst33342荧光染色IGF-1组细胞核完整,核碎裂、核固缩少见;电镜观察IGF-1组细胞核形态结构正常及分泌颗粒数量相对增加。结论:IGF-1可以直接作用于胰岛细胞,具有促进胰岛素分泌的作用,并有抵抗细胞凋亡作用,这种功能可能与诱导抗凋亡因子Bcl-2高表达有关系。

参考文献

[1]Endoplasmic reticulum stress-induced apoptosis is partly mediated by reduced insulin signaling through phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and increased glycogen synthase kinase-3beta in mouse insulinoma cells.Srinivasan S,Ohsugi M,Liu Z,etal.Diabetes.2005

[2]Randomised place bo-controlled trial of human recombinant insulin-like growth factor-Ⅰplus intensive insulin therapy in adolescents with insulin-dependent diabetes mellitus.Acerni CL etal.The Lancet.1997

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[4]Total insulin and IGF-1 resistance in pancreatic beta cells causes overt diabetes.Ueki K,,Okada T,HuJ,etal.Nature Genetics.2006

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[6]High glucose potential tescyto kine and streptozotocin induced apoptosis ofrat islet cells:effecton apoptosis relatedgenes.Mellado GilJM,Aguilar,Diosdado M,et al.Journal of Endocrinology.2004

[7]Pioglitazone and sodiumsalicy late protect human beta cell sagainst apoptosism,and in pairedfunction induced by glucose and interleukin-1 beta.ZeenderE,MaedlerK,BoscoD,etal.JClinEndoMetab.2004

[8]余丽菲.胰岛素样生长因子-1在高糖条件下对大鼠胰岛功能及凋亡影响的研究[D].广西医科大学,2007.