人趋化样因子受体1抗体(CMKLR1Ab)ELISA试剂盒

背景^[1-6]

人趋化样因子受体1抗体(CMKLR1Ab)ELISA试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被样本抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的样本呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

免疫分析检测是一项应用广泛的技术，利用抗原和抗体的特异性反应进行检测的一种手段，广泛用于医学病理学、免疫组织化学、分子生物学、生物制药等领域的分析研究与技术测定。制备高特异性、高效价的抗体是实验免疫学技术的基础，抗体质量的高低将直接影响试验的成败。抗体纯化能降低非特异性本底，抗体标记能通过标记物的增强放大效应提高检测灵敏度，采用ELISA、WB、IP、IHC等不同免疫分析技术检测各种样品中特定的目的蛋白。

操作步骤：

1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。

2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；

3.样本孔先加待测样本10μL，再加样本稀释液40μL；空白孔不加。

4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。

5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。

6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。

7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

结果判断：

绘制标准曲线：在Excel工作表中，以标准品浓度作横坐标，对应OD值作纵坐标，绘制出标准品线性回归曲线，按曲线方程计算各样本浓度值。

操作注意事项：

1.试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，这属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2.实验中不用的板条应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。

3.浓度为0的S0号标准品即可视为阴性对照或者空白；按照说明书操作时样本已经稀释5倍，最终结果乘以5才是样本实际浓度。

4.严格按照说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

5.所有液体组分使用前充分摇匀。

应用^[7][8]

人趋化样因子受体1抗体(CMKLR1Ab)ELISA试剂盒可用于检测肿瘤微环境中趋化因子的表达和功能调节：

趋化因子是能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子,分子量多在8-14kDa之间。

趋化因子与趋化因子受体结合后传递多种细胞信息。趋化因子受体是7次跨膜G蛋白偶联受体中的一个家族。根据他们的两个保守的N-末端半胱氨酸残基,趋化因子及其受体分为CXC,CC,C,and CX3C家族。趋化因子基因分布在4q12-q13染色体（CXC主要趋化中性粒细胞）,4q21,和17q11.2（CC主要趋化单核细胞）。趋化因子受体的基因组存在于2和3染色体。许多趋化因子有着共同的受体和并能与多种受体结合。人们对趋化因子的最初认识是其能够趋化白细胞,现已被证明他们对多类型的细胞,包括T淋巴细胞均有趋化作用。

趋化因子能诱导白细胞特别是T淋巴细胞,向炎症反应和肿瘤浸润局部移动。致癌信号通路促进肿瘤的生长和入侵,也影响抗肿瘤免疫反应,包括免疫细胞动员。Notch信号传递途径的自然活化见报于白血病,乳腺癌,肺癌,粘液瘤,卡波西氏肉瘤,神经母细胞瘤,胰腺癌,宫颈癌,以及黑色素瘤,此为探讨Notch信号传递途径作为一种治疗肿瘤的目标提供科学基础。然而,Notch信号传递途径的活化对趋化因子表达的影响尚未经研究调查。

Notch信号途径传递从细胞表面的配体结合信号到细胞核转录系统。因此,人们试图用药物抑制gamma-secretase的活性以阻断Notch蛋白裂解,或siMAML1转染以阻断Notch信号转录活动。人黑色素瘤细胞系M624经小siMAML1转染后多种基因的表达,发现Tweak受体（TweakR,Fn14）和几个趋化因子包括CCL2的表达显著上调。

参考文献

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[5]Lysophosphatidic acid stimulates fas ligand microvesicle release from ovarian cancer cells[J].Yuru Meng,Shijun Kang,David A.Fishman.Cancer Immunology,Immunotherapy.2005(8)

[6]TWEAK Attenuates the Transition from Innate to Adaptive Immunity[J].Heather Maecker,Eugene Varfolomeev,Frank Kischkel,David Lawrence,Heidi LeBlanc,Wyne Lee,Stephen Hurst,Dimitry Danilenko,Jun Li,Ellen Filvaroff,Becky Yang,Dylan Daniel,Avi Ashkenazi.Cell.2005(5)

[7]LYSOPHOSPHOLIPID RECEPTORS:Signaling and Biology[J].Isao Ishii,Nobuyuki Fukushima,Xiaoqin Ye,Jerold Chun.Annual Review of Biochemistry.2004

[8]康世均.肿瘤微环境中趋化因子的表达和功能调节[D].南方医科大学,2009.