人重组人脂肪因子(RHC)ELISA试剂盒

背景^[1-7]

人重组人脂肪因子(RHC)ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附实验（ELISA）.已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用。产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。

实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人重组人脂肪因子（RHC）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人重组人脂肪因子（RHC）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。

样本处理及要求：

1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。

4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。

应用^[8][9]

人重组人脂肪因子(RHC)ELISA试剂盒用于重组人脂肪因子chemerin对巨噬细胞凋亡影响及其机制的研究：

冠心病患者心外膜脂肪组织中chemerin的m RNA及蛋白表达明显增高,且与冠状动脉粥样硬化严重程度正相关。脂肪因子chemerin被发现可以促进单核巨噬细胞黏附及泡沫细胞形成,而这两个病理过程在As发生、发展过程中发挥着重要作用。巨噬细胞凋亡贯穿于As的各个阶段,其在As病变晚期,可引起继发性细胞坏死和炎性反应,促进斑块脂质核心的形成及扩大,而且巨噬细胞凋亡后释放出的蛋白酶等可损伤纤维帽,最终导致不稳定斑块(即易损斑块)的形成。

本研究旨在探讨chemerin对巨噬细胞凋亡的影响及其作用机制,从而为As及冠心病的预防和治疗提供新的干预靶点。明确JNK及P38MAPK信号通路的作用根据以上实验确定重组人chemerin的实验浓度,设立重组chemerin组和中和chemerin组;重组chemerin组和中和chemerin组分别应用10μmol/l JNK阻断剂(SP600125)和10μmol/l P38MAPK阻断剂(SB203580)进行干预,再进行上述实验阻断JNK信号通路可明显削弱chemerin的促巨噬细胞凋亡作用。

但应用JNK阻断剂后的重组chemerin组和中和chemerin组仍然有差异(P(27)0.05),则提示尚有其它通路参与chemerin的促巨噬细胞凋亡过程。进一步阻断P38MAPK通路,重组chemerin组和中和chemerin组在应用P38MAPK抑制剂前后的差值分别为11.82%±0.60%和7.65%±0.83%,前者明显高于后者,差异有统计学意义(P(27)0.05)。由此推断,P38MAPK信号通路亦参与了chemerin的促巨噬细胞凋亡过程。结论重组人chemerin可促进FC诱导的巨噬细胞凋亡,并且JNK及P38MAPK信号通路参与此凋亡过程。

参考文献

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