鲁索利替尼的药理研究

背景及概述^[1][2]

鲁索利替尼(Ruxolitinib)是蛋白激酶JAK1和JAK2的小分子抑制剂，于2011年FDA批 准首个治疗骨髓纤维化药物，2014年新增适应症，用于治疗真性红细胞增多症患者。2015年全球的市场销售额为10.1亿美元，2016年全球的市场销售额为14.34亿美元。

中间体合成^[1]

(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈是合成鲁索利替尼(ruxolitinib)重要中间体。2011年，FDA批准鲁索利替尼用于患有中或高风险骨髓纤维化患者的治疗，2014年， FDA批准鲁索利替尼用于治疗真性红细胞增多症。目前国外报道该药也可用于治疗斑秃，在这 方面的研究工作在进一步开展中，因此，该药的研究具有重要意义。

CN201610008099.9提供一种方法简单、产率高、成本低的(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1- 基)-3-环戊基丙腈的合成方法。为了实现上述目的，本发明的技术方案是：(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊 基丙腈的合成方法，是以3-环戊基-2-氰基丙烯酸烷基酯为原料，在手性方酰胺催化剂存在 下与4-溴-1H-吡唑经Michael加成、水解、脱羧得(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈。本发明的方法可用下述反应式表示：

实施例：

(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈的合成方法，通过下述步骤实现：

1)(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-2-氰基-3-环戊基丙酸乙酯的制备

向25ml单口瓶中加入3-环戊基-2-氰基丙烯酸乙酯1.93g(0.01mol)，手性方酰胺 催化剂化合物Ⅲa 0.45g(0.001mol)，4-溴-1H-吡唑1.59g(0.0108mol)，15mL干燥甲苯，-20 ℃下反应10小时左右，TLC跟踪反应，反应毕，减压浓缩移除溶剂，残留物直接用于下步反 应。

2)(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈的制备

向步骤1)的残留物中加入质量分数为25％的氢氧化钠溶液2.1g(0.013mol NaOH)，升温至65℃回流8小时左右至TLC跟踪反应至水解完全，用质量分数为35％的盐酸调 pH至3左右，升温至100℃回流，至TLC跟踪反应脱羧完全，冷却至室温，加入10mL甲苯，静止 分层，水层用甲苯(3*10mL)萃取，合并有机层，有机层用饱和食盐水洗涤，用硫酸镁干燥，减 压回收甲苯得到(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈粗产品2.35g，对映体超量 91％ee。粗产品用10mL正己烷重结晶得到白色针状结晶2.14g，产率为80％，对映体超量 98％ee。

目标产物的氢谱、碳谱及高压液相色谱的检测数据如下：

¹H NMR(400M Hz，CDCl₃)δ(ppm):7.52-7.51(m，2H)，4.12(d d d，J＝9.8，8.5，4Hz， 1H)，3.02(d d，J＝17.3，8.5Hz，1H)，2.86(dd，J＝17.3，4.0Hz，1H)，2.48(m，1H)，1.96-1.88 (m，1H)，1.78-1.45(m，5H)，1.19(m，2H)；

¹³C NMR(100.61M Hz，CDCl₃)δ(ppm):140.8，129.3，116.8，93.4，64.5，30.2，30.0， 25.5，24.9，23.5；

HPLC(Chiracel AD-H，λ＝210nm，n-Heptane:EtOH＝90:10，1.0ml/min):TR＝ 26.8min(major peak)and 22.3min；91％ee(98％ee after recrystalization)

药理研究^[2]

谢旭磊等人研究了JAK2V617F突变阳性骨髓增殖性肿瘤(MPN)组织中JAK2V617F突变量与磷酸化Janus激酶2(p-JAK2)、细胞因子信号转导抑制蛋白1(SOCS1)、含SH2结构域蛋白酪氨酸磷酸酶1(SHP1)表达的关系，并探讨JAK2抑制剂鲁索利替尼(ruxolitinib)对JAK2V617F突变阳性人红白血病细胞系HEL细胞的增殖和HEL细胞中SOCS1、SHP1表达的影响。

方法纳入2012年7月至2016年8月于河北省人民医院和保定市医院就诊的48例JAK2V617F突变阳性的MPN患者为MPN组，同期24例贫血患者为对照组。采用免疫组织化学法检测骨髓组织标本中p-JAK2、SOCS1和SHP1的蛋白表达水平。SOCS1、SHP1蛋白表达量与JAK2V617F突变量的相关分析采用Spearman等级相关分析。用不同浓度(50、100、250、500、1 000 nmol/L)的鲁索利替尼处理HEL细胞后，采用CCK-8法检测HEL细胞的活力，q PCR法检测MPN组织和HEL细胞中JAK2V617F突变量以及HEL细胞中JAK2、SOCS1、SHP1 m RNA表达水平，蛋白质印迹法检测HEL细胞中JAK2、p-JAK2、SOCS1、SHP1的蛋白表达水平。

结果 (1)MPN组织中JAK2V617F/JAK2比值为(57.33±20.82)%，对照组为0%。MPN患者骨髓细胞质中p-JAK2、SOCS1、SHP1蛋白质表达量与对照组相比差异均有统计学意义(P均<0.01)。

(2)MPN组织中SOCS1、SHP1蛋白表达量均与JAK2V617F突变量呈负相关(r=-0.648、-0.692，P均<0.05)。JAK2V617F/JAK2比值<50%MPN患者的SOCS1、SHP1蛋白表达水平高于JAK2V617F/JAK2比值≥50%的MPN患者(P均<0.01)，p-JAK2的蛋白表达水平低于JAK2V617F/JAK2比值≥50%者(P<0.01)。

(3)250 nmol/L鲁索利替尼处理24、48、72 h后，HEL细胞活力分别为(60.06±3.87)%、(52.05±2.88)%、(36.43±2.01)%。随着鲁索利替尼浓度的增加，HEL细胞中JAK2的m RNA和蛋白表达与p-JAK2的蛋白表达水平逐渐降低(P<0.01，P<0.05)，SOCS1和SHP1的m RNA和蛋白表达逐渐增加(P均<0.01)。

结论鲁索利替尼能够抑制HEL细胞中JAK2的m RNA和蛋白表达及其磷酸化水平，增加SOCS1、SHP1 m RNA和蛋白表达，降低HEL细胞的活力。

主要参考资料

[1] CN201610008099.9 鲁索利替尼中间体(R)-3-(4-溴-1H-吡唑-1-基)-3-环戊基丙腈的合成方法

[2] 谢旭磊，杨圣俊，郝洪岭，王素云，王红杰，齐峰，成志勇，刘贵敏.SOCS1、SHP1在JAK2V617F突变阳性骨髓增殖性肿瘤中的表达及鲁索利替尼的调控作用[J].第二军医大学学报，2018，39(01):74-80.