黄曲霉毒素 B1的检测

发布日期:2020/4/9 8:01:47

背景及概述^[1][2]

黄曲霉毒素被世界卫生组织（WHO）的癌症研究机构划定为1类致癌物。目前已鉴定分离出AFB1、AFB2、AFG1、AFG2、AFM1、AFM2、AFP1、AFQ1和AFH1等十多种黄曲霉毒素，其中黄曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，简称AFB1）的毒性和致癌性最强。AFB1的强毒性、高致癌性以及存在的广泛性，对人类健康安全和畜牧业等造成了严重的威胁。

检测^[1]

目前可分离定量检测AFB1的方法主要有薄层色谱法，高效液相色谱法，液相色谱-串联质谱法以及免疫分析方法。这些方法大多需要体积庞大、价格昂贵的检测设备，并且操作步骤繁琐，检测周期长，不利于现场即时检测。因此，开发一种基于血糖仪检测黄曲霉素 B1的方法，实现对黄曲霉素B1这一非糖靶目标的快速简单、高灵敏度检测，具有广泛的应用前景。

一种利用血糖仪定量检测黄曲霉毒素B1的方法，包括以下步骤：

步骤一：制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物；

步骤二：将黄曲霉毒素B1的单克隆抗体，4℃孵育12h；用缓冲液B冲洗；然后加入封闭缓冲液，室温封闭1h；用缓冲液A冲洗，完成黄曲霉毒素B1的单克隆抗体的固定；

步骤三：向步骤二的黄曲霉毒素B1的单克隆抗体中加入不同浓度的黄曲霉毒素B1待测液，37℃孵育1h，使黄曲霉毒素B1与黄曲霉毒素B1的单克隆抗体进行特异性结合，用缓冲液 A冲洗未与单克隆抗体结合的黄曲霉毒素B1，得到黄曲霉毒素B1与单克隆抗体的结合体；

步骤四：在步骤三所得的结合体中加入步骤一制备的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物，37℃孵育2h，形成具有夹心式结构的单克隆抗体-黄曲霉毒素B1-检测探针复合物，未与结合体上的黄曲霉毒素B1结合的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物留在上层上清液中；

步骤五：取步骤四的上清液，加入蔗糖溶液，37℃孵育30min后，用血糖仪进行定量检测。

进一步地，所述制备纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的步骤如下：

a）将蔗糖酶加入到胶体金中混合，4℃孵育6h，得到纳米金-蔗糖酶复合物；

b）向黄曲霉毒素B1的核酸适配体中加入TCEP试剂，室温，黑暗条件下，反应2h激活黄曲霉毒素B1的核酸适配体；

c）将步骤b）激活后的黄曲霉毒素B1的核酸适配体加入到步骤a）的纳米金-蔗糖酶复合物中，在振荡培养箱中50r/min、37℃孵育16h，形成纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物；

d）将步骤c）的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体复合物离心，取出上清液，先用少量的缓冲液A冲洗沉淀物，再用缓冲液A溶解沉淀物，室温涡旋震荡5min，得到纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针，并在4℃保存。

相比现有技术，本方法的有益效果在于：

1.本方法采用胶体金作为标记物，因为胶体金能稳定又迅速地吸附蛋白质，而蛋白质的生物活性无明显改变，它可以作为探针对细胞表面和细胞内多糖、蛋白质、多肤、抗原、激素、核酸等生物大分子的精确定位；同时胶体金具有以下特点：使用方便快速，便于基层使用和现场使用成本低，不需要特殊的仪器设备；应用范围广，可适应多种检测条件，可以进行多项检测，多项检测可以节省样品；降低成本，标记物稳定，标记样品在4℃贮存两年年以上，无信号衰减现象；

2.传统的检测大分子物质的方法，都是单一利用抗体与目标物结合，或是核酸适配体与目标物结合，从而间接测出目标物的量，而本方法中形成了具有夹心式结构的单克隆抗体-目标物（黄曲霉毒素B1）-检测探针复合物，通过抗体、核酸适配体同时与目标物结合，具有更强的特异性，且与待测物中的目标分子结合效果更好，通过检测上清液中剩余的纳米金-蔗糖酶-核酸适配体检测探针复合物的量，得到较强的血糖仪信号值，使得检测结果更加精确、定量检测范围更广；

3.本方法利用家用便携式血糖仪进行检测，相比利用传统的大型检测设备，具有体积小、成本低和操作简单的特点，可为日常生活、生产等方面提供一种黄曲霉毒素B1的快速检测方法，保障食品安全。

去除方法^[2]

现有技术中去除黄曲霉毒素B1的方法有：氨化法(是美国专利方法)，该法用于含水饲料的毒素去除，有效率达98％，但因处理后食品中含大量的氨，美国FDA规定此法不能用于食品加工。NaOH法(曾用于植物油除去毒素)，用强碱把毒素变成盐，再用水洗。由于设备投资大、油耗大、成本高的缺点，现已被淘汰；混合溶剂萃取法：用一些有机溶剂如：95％乙醇溶液，80％2-丙醇，90％丙醇及多种乙烷和乙醇混合物从样品中萃取黄曲霉毒素B1，该方法用于如花生粉，棉籽等固态食品的毒素去除，效率可达93-98％，能保持产品中蛋白质的数量和质量，但在萃取、溶剂回收和处理时花费昂贵，无推广应用价值。

高温法：用高压锅蒸煮污染的花生食品2小时或在含水量20％条件下将食品在100℃加热2小时；由于黄曲霉毒素B1 耐热，须超过250℃高温才会分解，但过高温度同时会破坏食品中的基他营养成分，故不作为解毒的主要手段。其他如：次氯酸钠、臭氧、过氧化氢、甲醛、氯气等化学法，它们运用强烈的化学试剂破坏毒素，所以，同时也破坏了食品中的许多营养成分。超滤-渗滤法，用该法处理的全奶其AFM1含量可由最初的2.5μg/L下降到0.5 μg/L，但经处理后的牛奶、脂肪、乳糖以及灰分和总固形物最高可损失23％，且该法对均相化或酸化的牛奶无效。

一种黄曲霉毒素B1解毒酶去除黄曲霉毒素B1的方法，其特征是将黄曲霉毒素B1解毒酶直接与含毒样品作用，体系呈PH7.0-8.5，或间接地先以载体固定化后再与含毒样品作用，于20-70℃作用5-120 分钟。

——所述地载体可以是甲壳素、硅胶、氧化铝、琼脂珠、多孔玻璃珠等多孔材料、惰性基质、或经活化处理的惰性基质。

——所述的含毒样品可以是植物油、酱油啤酒、奶及其制品。

下面通过实施例作进一步详述：

取含毒样品10ml，加入黄曲霉毒素B1解毒酶400μg，用磷酸盐缓冲液调至体系PH7.5，在温度为40℃作用40分钟即可去除样品中的黄曲霉毒素B1。本发明的方法专一，高效，温和和安全。该解毒酶能够破坏黄曲霉毒素B1的致毒、致癌活性，能够较好地保持食品的原有品质，因而本发明可安全无毒地用于食品加工业。