替度鲁肽的制备

背景^[1]

替度鲁肽，英文名为Teduglutide，一种胰高血糖素样肽2（GLP-2）类似物，一种天然生成的激素，可减少胃排空和分泌，并调节小肠内膜细胞的生长、增殖和修复。该药增加了这些细胞的数量，后者可增加小肠吸收、减少腹泻。欧洲商品名为Revestive，在美国商品名为Gattex。在临床上用于治疗成人短肠综合征。该药成为首个被推荐应用于这种罕见却使患者极其虚弱疾病的药物，结构式和肽序如下：

替度鲁肽

目前，对替度鲁肽的合成方式主要有顺序偶联和片段偶联两种方法，其中顺序偶联是以wang树脂为载体，采用纯固相顺序偶联的方法进行肽的合成，最终切割得到替度鲁肽；片段偶联则是先合成具有SEQ ID NO：2所示结构的全保护片段，然后采用纯化后的全保护片段与具有SEQ ID NO:12所示结构的片段肽树脂进行固相偶联，最终裂解得到替度鲁肽。

由于替度鲁肽的肽链较长，采用顺序偶联的方式合成会使合成的难度增大，并产生难以纯化的杂质，降低回收率。而更重要的是，替度鲁肽的N端第3～第4个氨基酸为Asp-Gly，天冬氨酸（Asp）侧链中的羧基能与酰胺键中的-H成五元环，这种五元环结构一旦形成，会在一定条件下降解开环，而在开环过程中会产生多种杂质，例如：Asp的消旋、产生α,β天冬氨酸等，造成替度鲁肽纯度的下降。

研究表明，五元环结构的形成与Asp或Asn的右侧氨基酸有重大关系，而Gly由于侧链没有保护基团且空间位阻小，当Gly先于Asp偶联时最易成环的结构。因此采用顺序偶联的方式必然会使替度鲁肽的N端第3～第4个氨基酸在合成的过程中生成五元环，从而造成纯度的降低。因此，为了解决Asp-Gly片段产生降解的问题，采用片段偶联的方式先合成具有SEQ ID NO:2所示结构的全保护片段，该全保护片段即为替度鲁肽的N端第1～第4个氨基酸，其中包括Asp-Gly结构，然后对该全保护片段进行纯化，并采用纯化后的全保护片段与具有SEQ ID NO:12所示结构的片段肽树脂进行固相偶联，最终裂解得到替度鲁肽。

但是，虽然在固相偶联之前已经对会产生降解杂质的全保护片段进行了纯化，不但增加了制备步骤，且无法保证其在后续的固相偶联过程中不发生再一次的降解。因此，采用这种片段方法不能从根本上解决Asp-Gly片段产生降解的问题。检测表明，以现有技术制备替度鲁肽现有技术制备的醋酸替度鲁肽的收率为20%，纯度为98.5%，其中Asp-Gly片段降解产生杂质的含量为0.2%。

制备^[2]

1.Fmoc-His(Trt)-Gly-OH(多肽片段1)的合成

在10L三口玻璃反应瓶中加入1220g(2mol)Fmoc-His(Trt)-OH和230g(2mol)HOSu用4000ml DMF溶解30分钟再加入412g DIC室温搅拌反应2小时，最后加入402g(2mol)Gly-OBzl.HCl和300ml(2mol)三乙胺反应10小时，反应完成缩合成Fmoc-His(Trt)-Gly.OBzL保护二肽。用10倍反应液体积水沉淀，过滤收集沉淀，并用大量的水洗涤，减压干燥。送检合格后，固体用50％乙醇水溶液溶解，加入50g 5％Pd/c，催化氢解16小时，完毕浓缩乙醇，过滤产品减压干燥得最终成品644.2g Fmoc-His(Trt)-Gly-OH，收率47.6％。

2.Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH(多肽片段2)的合成

在10L三口玻璃反应瓶中加入422g(2mol)Fmoc-Asp(OtBu)-OH和230g(2mol)HOSu用4000mlDMF溶解30分钟再加入412g DIC室温搅拌反应2小时，最后加入402g(2mol)Gly-OBzl.HCl和300ml(2mol)三乙胺反应10小时，完成缩合成Fmoc-Asp(OtBu)-Gly.OBzL保护二肽。用10倍反应液体积水沉淀，过滤收集沉淀，并用大量的水洗涤，减压干燥。送检合格后，固体用50％乙醇水溶液溶解，加入50g 5％Pd/c，催化氢解16小时，完毕浓缩乙醇，过滤产品减压干燥得最终成品402.1g Fmoc-Asp(OtBu)-Gly-OH，收率42.9％。MW:468。

3.Fmoc-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂的合成

取500g取代值为0.6mmol/g的2-Cl Trt-Cl树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.6mol Fmoc-Asp(OtBu)，用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.2mol DIEA，搅拌反应3小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂，取代值为0.46mmol/g。

4.Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂的合成

取500g取代值为0.5mmol/g的Wang树脂，加入DMF溶胀树脂。取0.5mol Fmoc-Asp(OtBu),用适量DMF溶解，加入到上述树脂中，搅拌均匀后再加入1.0mol DIC、0.4molHOBt、0.04mol 4-N,N-二甲基吡啶，搅拌反应6小时，抽掉反应液，DMF洗涤3次后，DCM洗涤3次，得到Fmoc-Asp(OtBu)-Wang树脂，取代值为0.41mmol/g。

5.多肽片段3和替度鲁肽树脂的合成

取0.1mol实施例4的Fmoc-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂(取代值约0.46mmol/g)，用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得到去Fmoc的H-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂。

取0.3mol Fmoc-Thr(tBu)和0.3mol HOBt，用适量DMF溶解；另取0.3mol DIC，搅拌下慢慢加入，继续搅拌反应30分钟，加入到上述H-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂中，偶联反应120～300分钟，反应终点以茚三酮法检测为准，洗涤过滤，再用20％PIP/DMF溶液去保护25分钟，洗涤过滤，得H-Thr(tBu)-Lys(Boc)-2-Cl Trt-树脂。得到多肽片段3：

H-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu)-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile- Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp(OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp (Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tBu)-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂

6.进行偶联，获得替度鲁肽树脂：

H-His(Trt)-Gly-Asp(OtBu)-Gly-Ser(tBu)-Phe-Ser(tBu)-Asp(OtBu)-Glu(OtBu )-Met-Asn(Trt)-Thr(tBu)-Ile-Leu-Asp(OtBu)-Asn(Trt)-Leu-Ala-Ala-Arg(Pbf)-Asp (OtBu)-Phe-Ile-Asn(Trt)-Trp(Boc)-Leu-Ile-Gln(Trt)-Thr(tBu)-Lys(Boc)-Ile-Thr(tB u)-Asp(OtBu)-2-Cl Trt-树脂。

主要参考资料

[1] 杜晓斌. (2012). 替度鲁肽联合膳食纤维促进肠适应的作用机制. (Doctoral dissertation, 天津医科大学).

[2] 胡银霞, 李兰, 袁瑜, 吴礼浩, & 何兴祥. (2016). 替度鲁肽对大鼠非酒精性脂肪性肝病的治疗作用. 世界华人消化杂志(7), 1009-1016.

[3] 杨君义. (2017). 治疗短肠综合征新药:替度鲁肽. 中国新药与临床杂志(08), 30-32.