大鼠骨髓来源内皮祖细胞

背景^[1-6]

大鼠骨髓来源内皮祖细胞主要存在于骨髓、脐血和外周血，但是少量的内皮祖细胞也被发现存在于脂肪组织、脾脏、心脏、血管、骨骼肌部位。在组织缺血部位，内皮祖细胞参与血管的新生。最近的证据表明心血管功能和血管发生受到起源于骨髓的循环的未成熟细胞的显著调节，增加血管发生，提高血管修复和改善内皮功能。外周血中所含内皮祖细胞极低，因此选用骨髓来分离内皮祖细胞。

采用免疫磁珠法虽然获得的细胞纯度较高，但是操作复杂，费用昂贵，因此目前已较少采用。因此，在心肌梗死、动脉粥样硬化、糖尿病周围血管病变等缺血性疾病中，内皮祖细胞有广泛的应用前景。但内皮祖细胞的分离、培养及鉴定方法目前并不统一。

大鼠骨髓内皮祖细胞的分离培养与鉴定：

1单个核细胞的分离：SD大鼠脱臼处死，无菌条件下取胫骨及股骨，冲洗骨髓并吹打直至变为单细胞悬液。将细胞悬液小心加至等体积大鼠淋巴细胞分离液之液面上，2000r/min离心20min，用吸管吸取单个核细胞层洗涤细胞3次。收集到的细胞为单个核细胞。

2大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）的培养：用体积分数10%胎牛血清的EBM-2调整单个核细胞浓度为(2.5~5)×109L-1，接种于包被了25μg人纤维连接蛋白的T25瓶中。48h后首次换液，将悬浮细胞重新在37℃、体积分数5%CO2、饱和湿度下培养。72h后换液。以后每隔2d换液1次。

3大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）生长曲线的绘制：取培养第7天的内皮祖细胞，用新鲜培养基将细胞调整为1×108L-1，接种于96孔板，每孔加细胞悬液100μL，共接种42个孔。另选14个孔加入100μL不含细胞的培养基。使用法测细胞生长曲线连续测量14d。以培养时间为横轴，吸光值为纵轴，绘制生长曲线。

4大鼠骨髓内皮祖细胞（EPC）的鉴定：流式细胞仪检测：取新分离的单个核细胞、培养10，16，20d的细胞分别加入FITC标记的抗大鼠CD133，PE标记的抗大鼠CD34各2μL，送流式中心上机检测。空白对照加入FITC和PE标记的同型对照抗体。

5双荧光染色鉴定：取培养第7天的细胞，用PBS洗2遍，加入用完全培养基稀释的10mg/L的Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白1mL，于培养箱中孵育4h。用PBS洗3次。用40g/L多聚甲醛固定20min。加入用PBS稀释的10mg/L的FITC标记的荆豆凝集素11mL，孵育1h。以不加Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的荆豆凝集素1的细胞做阴性对照。于激光共聚焦显微镜下观察，拍照。主要观察指标：细胞形态、数量以及标志蛋白的鉴定。

应用^[7][8]

大鼠骨髓来源内皮祖细胞可用于肿瘤细胞培养上清液对大鼠骨髓来源内皮祖细胞功能和活性的影响及PI3K/Akt在内皮祖细胞分化中作用的研究：

内皮祖细胞（endothelial progenitor cells,EPCs）是一类参与循环增殖并能分化为血管内皮细胞（endothelial cells,ECs）,但还未能表达成熟血管内皮细胞表型,也未形成微血管的前体细胞。出生后EPCs主要存在于骨髓,在某些情况下可以被动员到外周血,归巢到靶组织参与生理或（和）病理性血管生成。血管的形成主要有两种方式:即血管新生和血管生成。血管新生（angiogenesis）是指通过血管内皮细胞迁移、增殖,在原有的血管上生长出新的血管。血管生成（vasculogenesis）是指在原来没有血管系统的情况下,通过EPCs和造血干细胞（hematopoietic stemcell,HSC）产生血流的新通道。

近来的证据表明,恶性肿瘤中不仅存在血管新生,还可能存在由EPCs介导并重新形成血管的血管生成。血管生成在肿瘤生长中是不可缺少的重要环节,越来越多的研究显示EPCs在肿瘤血管生成中起重要作用。EPCs的分化要通过复杂的信号通路调节细胞内部多种基因的表达,最终引起EPCs向成熟ECs分化。目前对EPCs分化的研究主要从形态和细胞表面标志两方面入手。在形态上无法将EPCs与其他细胞区分开来,所以主要靠分子标志识别。

AC133是新近发现的干细胞标记,不表达于成熟ECs,认为是目前区分血管EPCs与ECs的最主要标记。vWF（von Willebrand因子）贮存在ECs的Weibel-Palade小体中,血浆中vWF绝大部分系由ECs分泌,它是血管内皮的分子标志物。研究结果表明,纯化的AC133+细胞在体外能分化为ECs。在分化过程中,EPCs明显失去AC133,并开始表达成熟ECs特有的表面标志,如vWF。PI3K/Akt信号通路是调节各种细胞生长、代谢、分化的重要信号通路。

磷脂酰肌醇-3（羟基）激酶（Phosphatidylinositol-3（hydroxyl）kinase,PI3K）为生长因子受体超家族信号转导过程中的重要成员,可受多种细胞因子和理化因素激活。丝/苏氨酸蛋白激酶B（Ser/Thr protein kinase B,Akt）是位于PI3K下游的一个重要激酶,二者均是促进细胞生存和维持细胞正常功能关键的信息分子,并且共同构成细胞应激反应过程中促进细胞生长、抑制细胞凋亡和维持细胞重要功能的信号传递链。实验方法1、EPCs的分离、培养、纯化与鉴定采用Ficoll密度梯度离心法结合差速贴壁筛选法从大鼠骨髓分离EPCs;收集培养5d的EPCs,用激光共聚焦显微镜鉴定,AC133和vWF双染阳性细胞为正在分化的EPCs。

参考文献

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[7]Genetically tagging endothelial cells in vivo:bone marrow-derived cells do not contribute to tumor endothelium.Gothert JR,Gustin SE,Van Eekelen JA,et al.Blood.2004

[8]马颖.肿瘤细胞培养上清液对大鼠骨髓来源内皮祖细胞功能和活性的影响及PI3K/Akt在内皮祖细胞分化中作用的研究[D].中国医科大学,2008.